郁金提取物对CCI模型大鼠痛觉行为及BDNF表达的影响*

厉飞　裘涛　胡娅娜　陶水良

（1.浙江中医药大学，浙江杭州310053；2.浙江中医药大学附属第一医院，浙江杭州310006；3.浙江省金华市中医院，浙江金华321017；4.浙江中医药大学基础医学院，浙江杭州310053）

·研究报告·

郁金提取物对CCI模型大鼠痛觉行为及BDNF表达的影响*

厉飞1裘涛2胡娅娜3陶水良4△

（1.浙江中医药大学，浙江杭州310053；2.浙江中医药大学附属第一医院，浙江杭州310006；3.浙江省金华市中医院，浙江金华321017；4.浙江中医药大学基础医学院，浙江杭州310053）

目的探讨郁金提取物对神经病理性疼痛模型（CCI）大鼠痛觉行为及脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响。方法建立CCI大鼠模型，将SD大鼠分为正常组、模型组、郁金提取物低、中、高剂量组，加巴喷汀组和溶剂组，对各组大鼠进行机械缩足阈值（PMWT）测定，用ELISA法测定大鼠血清中BDNF的表达。结果（1）与正常组相比，造模后大鼠PMWT显著下降（P＜0.05），说明神经病理性模型造模成功；与溶剂组相比，郁金提取物高剂量组和加巴喷汀组显著上调CCI模型大鼠PMWT（P＜0.05）。（2）造模后大鼠血液内BDNF表达均较正常组显著增加（P＜0.05）；与溶剂组相比，郁金提取物中、高剂量组和加巴喷汀组能显著降低血液中BDNF的表达（P＜0.05）。郁金提取物高剂量组、加巴喷汀组和正常组BDNF表达无显著差异。结论郁金提取物可能通过降低CCI模型大鼠血清BDNF的表达而发挥抗神经病理性疼痛的作用。

郁金提取物神经病理性疼痛BDNF

神经病理性疼痛（NP）是一种由于损伤或疾病侵袭到中枢神经系统或躯体感觉系统后引起的慢性疼痛。如带状疱疹后神经痛、糖尿病神经系统病变、幻肢痛和残肢痛等。患者常有自发性疼痛、触诱发痛、痛觉过敏等症，亦可伴有焦虑、抑郁等精神症状，目前针对NP的发病机制尚未明确，传统用药疗效不佳［1-2］。越来越多的研究显示脊髓背角的小胶质细胞-神经元信号网络在神经病理性疼痛的发生和维持中具有重要作用［3］，当外周神经损伤后，小胶质细胞上的离子型嘌呤受体P2X4大量表达，通过钙离子和p38 MAPK的激活引起脑源性神经营养因子（BDNF）释放，最终导致NP［4-5］。本文将进一步探讨郁金提取物对大鼠神经功能及BDNF表达的影响。

1　材料与方法

1.1动物实验健康雄性清洁级SD大鼠36只，体质量250～294 g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。保证12 h明暗交替光照，自由饮食和饮水，适应环境1周后，随机分为正常组、模型组、郁金提取物低、中、高组、加巴喷汀组、溶剂组，每组4只。

1.2药物郁金提取物（含β-榄香烯＞80.0%）：浙江中医药大学药学院谷满仓老师提供［6］；加巴喷丁：江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20030662；无水乙醇：永华化学科技（江苏）有限公司，批号20130921；DMSO：美国AMRESCO公司；Tween-80：北京索莱宝科技有限公司；10%水合氯醛：浙江省中医院自制。

1.3仪器与试剂电子天平：奥豪斯中国地区；机械测痛仪：Ugo Basil Biological Research Apparatus，Comerio（va）Italy；大鼠脑源性神经营养因子ELISA检测试剂盒（CK-E30666R）。

1.4模型制备根据Bennettt-Xie建立CCI模型［7］，大鼠禁食12 h后，予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，消毒大鼠的右下肢，备皮后于股后暴露右侧坐骨神经主干，在接近其分叉之前用4根320的铬制羊肠线间隔1 mm进行松结扎，要求不阻断神经血供，然后逐层缝合切口。术后每只予青霉素4万U腹腔注射（80万U青霉素溶于2 mL 0.9%氯化钠注射液），连用3 d抗感染。术毕后将大鼠放入底部铺有软锯屑垫料的塑料盒中，予安静、温暖、避强光环境自由喂养。

1.5给药方法造模后，郁金提取物低、中、高剂量组分别给予郁金提取物60、120、180 mg/kg［8］，加巴喷丁组给予加巴喷丁100 mg/kg，溶剂组给予溶剂，其配置方法为DMSO1.5g与无水乙醇1.5g混合均匀后加Tween-80 4.5 g充分溶解，临用前用纯净水稀释至45 mL。用药各组在造模后第1日起按各组药物0.2 mL/100 mg灌胃给药，每日1次，连续给药14 d。正常组和模型组造模后均予正常喂养，不予任何药物干预。

1.6机械缩足阈值（PMWT）测定正常组、模型组于术后第3、7、14日，各给药组在给药第14日测定，测定时间为8：00～14：00。大鼠于机械测痛仪的有机玻璃箱中（22 cm×12 cm×22 cm），底为0.5 cm×0.5 cm孔径的铁丝网，实验之前适应15 min，以不同折力的Von Frey细丝垂直刺激大鼠右足足底，观察缩足反应，大鼠在折力达到一定值时，足底移开Von Frey针出现快速的缩足反应，此时的折力记录为PMWT，每只大鼠每次测量5次，每次测量间隔5 min，最大值为50 g，去掉1个最高值及1个最低值，取平均值即为其PMWT。

1.7ELISA分析正常组、模型组于术后第3、7、14日，各给药组在给药第14日予10%水合氯醛（0.3 mL/ 100 g）腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，按步骤进行ELISA分析BDNF含量。

1.8统计学处理应用SPSS13.0统计软件。计量资料以（±s）表示。各组用重复测量或单因素方差分析，多重比较采用LSD（方差齐时）或Tamhane’s T2（方差不齐时）法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠机械痛行为学比较见表1。与正常对照组比较，造模后大鼠PMWT值均显著降低（P＜0.01），提示造模成功，且随着造模后时间增加PMWT值呈下降趋势，说明造模14 d内机械痛域进行性降低；与模型组、郁金提取物低剂量组、郁金提取物中剂量组、溶剂组比较，郁金提取物高剂量组和加巴喷丁组PMWT值显著增高（P＜0.05）。

表1　各组大鼠神经行为学比较（g，±s）

与正常组比较，*P＜0.01；与郁金提取物高剂量组、加巴喷丁组比较，△P＜0.05。下同。

组别n正常组4模型组4郁金提取物低剂量组4机械缩足阈值33.33±3.21 12.35±1.78*13.53±2.62△郁金提取物中剂量组413.69±2.60△郁金提取物高剂量组419.11±2.55加巴喷丁组415.63±4.69溶剂组413.01±1.78△

2.2郁金提取物对神经病理性疼痛大鼠模型血清BDNF表达的影响见表2。与正常组相比，造模后大鼠血液内BDNF表达显著增加（P＜0.01）。与溶剂组相比，郁金提取物中、高剂量组和加巴喷丁组能显著降低血液中BDNF的表达（P＜0.05）。郁金提取物高剂量组、加巴喷丁组和正常组比较BDNF表达无显著差异。

表2　各组大鼠血液BDNF表达比较（pg/mL，±s）

表2　各组大鼠血液BDNF表达比较（pg/mL，±s）

与溶剂组比较，▲P＜0.05。下同。

组别n正常组4模型组4郁金提取物低剂量组4 BDNF 358.53±37.37 634.78±67.53*520.75±27.57*郁金提取物中剂量组4449.28±22.00*▲郁金提取物高剂量组4412.33±26.15▲加巴喷丁组4391.46±36.75▲溶剂组4468.55±26.41*

3　讨论

慢性神经结扎性损伤（CCI）是目前使用最广泛的神经病理性疼痛模型之一，其通过结扎坐骨神经来模拟神经病理性疼痛的症状，具有高度的重复性。本实验建模后出现大鼠右侧后足舔爪、跛行，安静状态下足趾并拢并保持防御姿势等现象，以上均提示建模成功。本实验结果显示CCI组大鼠术后各观察点PMWT值较正常组均显著降低，提示坐骨神经结扎后大鼠出现机械痛觉过敏。与模型组，郁金提取物低、中剂量组，溶剂组相比，郁金提取物高剂量及加巴喷丁组大鼠PMWT值明显升高，提示两者均具有一定的镇痛作用。

BDNF是一种神经营养因子，在神经元的生成、分化中有着重要的作用，同时也是神经活动和突触可塑性的重要调节因子［9］，近年来研究显示其在神经病理性疼痛方面也具有重要意义［10］。外周或中枢神经损伤后，在CCL2［11］、CCL21［12］及INF-γ等的作用下，小胶质细胞上的P2X4受体大量表达，通过钙离子内流和p38 MAPK的活化引起BDNF、细胞因子和炎症趋化因子等大量释放，BDNF既可以作用于神经元，增强突触前初级传入神经末梢伤害性神经递质的释放以及突触后痛觉传递神经元的敏感性和反应性，亦可进一步活化胶质细胞释放更加多的细胞因子，形成正反馈效应，从而引发持续性的神经病理性疼痛。Ferrini F等［13］通过研究显示，产生于小胶质细胞的BDNF通过与神经元TrkB的结合影响K+-Cl-协同转运蛋白2的（KCC2）功能，从而降低神经细胞中的Cl-浓度，最终减弱GABAAR/GlyR的抑制作用，导致触诱发痛等神经病理性疼痛的产生。

本实验结果显示，与正常组相比，造模后第3、7、14日大鼠血液内BDNF表达均显著增加（P＜0.01），说明坐骨神经损伤可导致BDNF大量释放。与溶剂组相比，郁金提取物组和加巴喷汀组能显著降低血液中BDNF的表达（P＜0.05），并且提高大鼠的机械缩足阈值，同时实验结果提示正常组、郁金提取物高剂量组和加巴喷汀组大鼠血液中BDNF表达无显著差异，说明郁金提取物可能通过调节CCI模型大鼠血清BDNF至正常水平而达到抗神经病理性疼痛的作用。Chen HS等［14］也通过研究显示，鞘内注射BDNF抗体能显著改善脊神经前根横断导致的机械痛超敏，并呈现剂量依赖性。而Constandil L等［15］研究提示鞘内注射0.003 ng的BDNF就能显著降低正常小鼠的疼痛阈值，但不呈剂量依赖性，即随着BDNF注射剂量的增加，疼痛阈值下降程度及疼痛持续时间并不相应增加。综上所述，本研究通过观察郁金提取物对CCI疼痛模型中大鼠PMWT阈值和BDNF表达的影响，证实郁金提取物可以抑制CCI模型大鼠BDNF的释放，提高PMWT阈值，从而缓解神经病理性疼痛，为临床治疗神经病理性疼痛提供了新的靶点。

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Effect of Turmeric Extraction in Attenuation of Pain Behavior and BDNF Expression with CCI Rats

LI Fei1，QIU Tao2；HU Yana3，et al.1 Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China；2 The First Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310006，China；3 Jinhua Hospital of TCM，Zhejiang Province，Zhejiang，Jinhua 321017，China

Objective：To investigate the effect of turmeric extraction on pain behavior and the BDNF expression in neuropathic pain model（CCI）rats.Methods：36 SD rats were divided into normal group，model group，turmeric extract low，medium and high dose groups，gabapentin group and solvent group.Each rat was tested with PMWT，and BDNF expression in rats'serums were detected by ELISA.Results：（1）Compared with the normal group，the thresholds of PMWT were significantly decreased after the establishment of CCI model（P＜0.05），which indicated the successful establishment of CCI rats model.Compared with the solvent group，PMWT thresholds were significantly upregulated in turmeric extract high dose group and gabapentin group（P＜0.05）.（2）Compared with the normal group，BDNF expression were extraordinarily increased after the establishment of CCI model（P＜0.05）.Compared with the solvent group，the expressions of BDNF in serum in turmeric extract medium，high dose group and gabapentin group were significantly reduced（P＜0.05）.Turmeric extraction high-dose group，gabapentin group and the normal group had no significant difference in BDNF expression.Conclusion：Turmeric extraction can attenuation neuropathic pain by reducing serum BDNF expression in CCI rat model.

Turmeric extraction；Neuropathic pain；BDNF

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0030-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.010

2014-10-14）

浙江省中医药管理局科研课题（2013ZB031）

（电子邮箱：lanethtao@163.com）