痰热清注射液对急性肺损伤大鼠的肺组织核因子-κB表达的影响*

闫龙　来毅

（浙江省杭州市萧山区第一人民医院，浙江杭州311200）

·研究报告·

痰热清注射液对急性肺损伤大鼠的肺组织核因子-κB表达的影响*

闫龙来毅

（浙江省杭州市萧山区第一人民医院，浙江杭州311200）

目的通过建立急性肺损伤（ALI）大鼠模型，研究痰热清注射液对ALI治疗作用及可能机制，为其临床应用于感染所致的ALI提供理论参考。方法将SD大鼠随机分为正常对照组、模型2、4、6 h组、痰热清2、4、6 h组，每组8只。尾静脉注射脂多糖（LPS）造模，痰热清组在造模后从另一尾静脉注射痰热清注射液1 mL。在相应时间段取肺组织，观察肺病理形态学、组织损伤程度，通过免疫组化检测NF-κB p65的表达变化。结果（1）LPS模型组肺组织有明显的形态、病理学改变；各时间段模型组NF-κB p65的阳性指数值较正常对照组升高（P＜0.01）。（2）痰热清2 h组NF-κB p65阳性指数与模型2 h组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；痰热清4 h与6 h组阳性指数值较同时间点模型组明显降低（P＜0.01），且与正常对照组无明显差异。结论痰热清注射液对ALI大鼠有保护作用，可以减轻其组织形态学改变，通过抑制肺组织NF-κB信号传导通路的活化，阻断炎症的级联式反应，从而减轻肺组织损伤，阻断ALI/ARDS的发生、发展。

痰热清注射液急性肺损伤NF-κBp65

全身性感染、创伤、休克、烧伤、急性重症胰腺炎等多种病因可引起急性肺损伤（ALI），其终末阶段或危重型称为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。以往的研究认为ALI的发病主要与机体过度的炎症反应有关，被致病因子激活后，炎症细胞大量聚集在肺中，生成大量的炎症介质和细胞因子，反馈并放大和加强炎症信号，最终导致肺泡上皮和肺毛细血管内皮通透性增加，肺泡水肿，构成低氧血症的病理基础。近年研究表明，核转录因子-κB（NF-κB）与炎症反应密切相关，其参与了多种细胞因子及炎症介质基因的转录调控，是炎性介质的上游调控基因，在炎症反应的细胞因子网络调节中起重要作用。由于ALI与炎症反应的关系密切，NF-κB在炎症反应发生发展中发挥重要作用，因此NF-κB很可能在ALI中起着关键的作用［1］。同时被认为是极具潜力的新型抗炎靶点［2］。本研究中采用尾静脉注射脂多糖（LPS）制备大鼠ALI模型，并用痰热清注射液进行治疗，观察肺病理形态学、组织损伤程度及NF-κB p65的表达变化。

1　材料与方法

1.1动物SD大鼠，雄性，体质量（200±10）g，清洁动物，浙江中医药大学实验动物中心提供，自由摄食、饮水、室温18～24℃，相对湿度40%～70%，每日12 h光照维持，昼夜循环。

1.2试药与仪器痰热清注射液，上海凯宝药业有限公司提供10 mL/支；脂多糖E.coli内毒素；购自Sigma公司。

1.3分组与造模将大鼠随机分为正常对照组、模型2 h组、模型4 h组、模型6 h组、痰热清2 h组、痰热清4 h组、痰热清6 h组，每组8只。适应性喂养1周后。正常对照组1组，尾静脉注射生理盐水1 mL。模型组及痰热清组予尾静脉注射LPS注射液5 mg/kg造模。痰热清组造模后予另一尾静脉注射痰热清注射液1 mL（按人和动物体表面积折算的等效剂量比值）。

1.4标本采集与检测动物分别在2、4、6 h予水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后开胸。观察肺组织形态学变化，后以10%甲醛溶液固定，行免疫组织化学染色后观察NF-κB p65的表达差异。HE染色切片在显微镜放大400倍下直接观察组织病理变化。免疫组化切片每张切片所要分析的部位显微镜下拍摄3～5张照片，采用图像分析软件：Carl Zeiss Imaging Systems进行分析。计算Area实际面积，平均光密度（Density）为阳性表达区域的光密度平均值，反映表达部位的阳性强度。总光密度（IOD）=∑Area（阳性表达部位）×Density（该部位的平均光密度），IOD表示照片内所有阳性表达部位的Area×Density的和。阳性指数：即IOD/肺泡实质面积（μm2），用DAB显色的免疫组化切片阳性区域为棕黄色，阳性指数表示总光密度均分到该照片的值，以此对NF-κB p65蛋白表达进行定量分析。

1.5统计学处理应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，均进行正态性检验，多样本均数比较进行方差齐性分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1组织病理学改变正常组大鼠肺组织结构完整，肺泡内无水肿、炎症，肺泡腔清晰。模型各组不同程度肺泡结构破坏，肺内单核巨噬细胞侵润及肺泡腔内红细胞明显增多，呈时间依赖性。痰热清各组肺泡组织结构较完整，轻度水肿，虽有不同程度的单核巨噬细胞浸润，红细胞漏出，但损伤程度相比同时间段模型组病变减轻。见图1。

2.2肺组织NF-κB p65蛋白表达肺组织免疫组织化学NF-κB p65蛋白阳性反应产物呈棕黄色。正常对照组可见少量散在的NF-κB p65阳性免疫反应产物，主要位于胞浆中，组织结构尚清晰。模型各组可见较多NF-κB p65阳性免疫反应产物，主要位于细胞核中。痰热清各组阳性表达率较模型组同时间点明显减轻。见图1。

图1　各组肺组织免疫组化切片（DAB显色，400倍）

模型各组NF-κB p65的阳性指数值较正常对照组升高（P＜0.01）。痰热清2 h组NF-κB p65阳性指数较模型2 h组差异无统计学意义（P＞0.05）；痰热清4 h与6 h组阳性指数值较相应时间点模型组明显降低（P＜0.01），与正常对照组无明显差异。见表1。

3　讨论

ALI的发病机制错综复杂，目前多从炎性细胞和细胞因子、氧化抗氧化系统失衡、凝血纤溶系统失衡及肺泡毛细血管膜损害这几方面进行阐述，目前尚未完全明了。注射LPS不仅可成功复制ALI模型，而且可以很好地模拟临床严重感染引发的ALI/ARDS［3］。NF-κB是调节细胞基因转录的关键因子之一，活化后的NF-κB在机体的炎症、免疫反应等方面发挥直接重要作用，与内毒素型ALI的发生与发展有密切关系。近年国内多项研究结果表明，中医药可通过调控NF-κB的活化，抑制炎症因子的趋化、表达等，较好干预多种疾病的临床治疗。本文通过大鼠尾静脉注射LPS诱导ALI，再予尾静脉注射痰热清注射液进行治疗，探讨痰热清注射液对ALI大鼠的保护作用及可能的机制。

表1　各组肺组织NF-κB p65阳性指数比较（±s）

表1　各组肺组织NF-κB p65阳性指数比较（±s）

与正常对照组比较，*P＜0.01；与同时间段模型组比较，△P＜0.01。

组别n正常对照组8模型2 h组8模型4 h组8阳性指数（×10-2）2.23±0.25 5.35±0.36*8.53±0.67*模型6 h组85.27±0.03*痰热清2 h组86.84±0.57*痰热清4 h组83.49±0.29△痰热清6 h组82.58±0.69△

肺损伤的作用机制中，众多细胞因子错综复杂，而NF-κB、AP-1的活化、激活起到了关键作用。NF-κB典型的结构为p50/p65异源二聚体，几乎存在于所有真核细胞。正常情况下，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合，以无活性的三聚体形式存在于细胞浆。当细胞受到多种细胞内外信号刺激时，IκB发生磷酸化并降解，NF-κB与IκB发生解离并活化，活化的NF-κB迅速从细胞浆移位到细胞核，并与相应基因上的κB位点相结合而发挥作用。研究表明，许多因素包括前炎性细胞因子（如TNF-α，IL-1β）、内毒素、氧自由基（ROS）、病毒等可以激活NF-κB［4］。而NF-κB被激活后又参与诸多因子如TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、氮自由基（NOS）及生长因子、黏附分子等的诱导性调控转录表达过程［5］。也就是说致病因素激活NF-κB后，引起ROS，炎症因子等释放，ROS及炎症因子又可以正反馈激活NF-κB、造成炎症级联放大，加重肺损伤。因此，NF-κB的转移并活化是全身炎症反应和急性肺损伤的关键发病环节之一［4］。有研究护津方可通过降低内毒素致急性肺损伤大鼠的NF-κB蛋白及NF-κB mRNA的表达，而对大鼠起到保护作用［6］。同样有类似研究证实抗炎合剂联合西医治疗能够明显减低脓毒症患者NF-κB水平［7］。总之各种炎症介质、氧化因子及血管通透性障碍、肺组织细胞损伤之间相互诱生、激活并正反馈性不断增加最终导致全身损害，导致MODS。因此，ALI/ARDS不是孤立的疾病，而是MODS的重要组成部分。在本组资料中研究结果显示LPS模型各组可见大量NF-κB p65阳性免疫反应产物，主要位于细胞核中，并且各时间点NF-κB p65的阳性指数值也较正常组升高（P＜0.01）。提示LPS大鼠尾静脉注射可造成大量的NF-κB的活化、激活，从胞浆转移入细胞核，参与ALI的发生、发展。

中医并无“急性肺损伤”这一病名的记载。根据临床表现，一般认为多归属于“喘证”、“暴喘”、“喘脱”等范畴。痰、热、瘀、闭是ALI/ARDS的主要病理因素，在临床上ALI/ARDS根据病程常可分痰热壅肺、气滞血瘀、肺热腑实、邪热闭窍、肺肾气虚等证候。中医药应该对ALI/ARDS的治疗从整体出发，辨证论治：早期多以标实为主，宜急去其实，可给予清热化痰、活血化瘀、通腑泻下等；晚期若标证缓解，可兼顾其虚则予益气扶正。本资料通过LPS尾静脉诱导大鼠ALI，导致大鼠30 min即出现萎靡，紫绀，呼吸困难进行性加重，甚或鼻翼煽动，腹泻，甚至死亡。

痰热清注射液由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花和连翘组成，具有平肝息风、清热解毒、宣肺解表等作用。黄芩的主要有效成分汉黄芩素有抑制炎症的作用，其抗炎效用与前列腺素E2水平呈正相关［8］。熊胆冻干粉针剂可轻度提高内毒素休克大鼠血浆IL-10水平，减轻内皮细胞损伤，发挥抗炎和免疫防御的作用［9］。金银花其主要有效成分绿原酸能抑制脂多糖增加肺中髓过氧化物酶（MPO）活性和中性粒细胞向BALF迁移；减轻LPS诱导的ALI小鼠肺组织的水肿、出血、血管和肺泡的结构破坏［10］。连翘的有效成分连翘苷（木脂素）能抑制花生四烯酸级联酶激活等而发挥抗炎作用［11］。现代药理研究亦证实痰热清注射液可明显抑制采用盲肠结扎穿孔术制备的脓毒症大鼠的NF-κB活性及IL-6水平，提高脓毒症大鼠的生存率［12］。本实验结果证实了，痰热清注射液治疗急性肺损伤的机理可能与抑制肺组织NF-κB信号传导通路的活化，阻断炎症的级联式反应，从而减轻肺组织损伤，阻断ALI/ARDS的发生、发展有关。

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Effects of Tanreqing Injection on NF-κB of Acute Lung Injury Induced by Endotoxin in Rats Lung Tissue

YAN Long，LAI Yi.The First People Hospital of Xiaoshan District，Hangzhou City，Zhejiang Province，Zhejiang，Hangzhou 311200，China

Objective：To investigate the infects and mechanisms of Tanreqing Injection on lipopolysaccharide（LPS）-induced acute lung injury（ALI）in rats.Methods：56 SD rats were randomly divided into 7 groups：normal control group，LPS model of 2 h，4 h，6 h group and Tanreqing Injection treatment of 2 h，4 h，6 h group. LPS was injected into tail vein in LPS model group and Tanreqing Injection treatment group.1 mL Tanreqing Injection was injected into another tain veil in Tanreqing Injection treatment group.The rats were killed at each observation time point.The pathological changes of lung were observed，and the expression of NF-κB P65 in lung tissue were detected with immunohistochemisty.Results：Compared with the control group，the pathological changes of lung in LPS model group were significant.Compared with the control group，the expression of NF-κB P65 in lung tissue was significantly up-regulated in LPS model group.Compared with LPS model group，the expression of NF-κB p65 in lung tissue in Tanreqing Injection treatment group were significantly downregulatedat 4 h and 6 h（P＜0.01）.Conclusion：Tanreqing Injection shows a protective effect on LPS-induced acute lung injury rats.The mechanism may be related to its ability of inhibiting the activation of the signal pathway of NF-κB and inflammatory cascade

Tanreqing Injection；Acute lung injury；NF-κB；p65

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0038-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.013

2014-03-12）

浙江省中医药普通课题研究计划（2009CA021）