破血化瘀填精补髓方剂对脑出血大鼠模型神经营养因子BDNF表达的影响*

张轶丹　赵建军　金曦　王泽玉　李霞　于兰　郑鹏　崔雅斌　荣春书　王庆伟　温泉

（长春中医药大学附属医院，吉林长春130021）

·研究报告·

破血化瘀填精补髓方剂对脑出血大鼠模型神经营养因子BDNF表达的影响*

张轶丹赵建军金曦王泽玉李霞于兰郑鹏崔雅斌荣春书王庆伟温泉

（长春中医药大学附属医院，吉林长春130021）

目的观察破血化瘀填精补髓方剂对脑出血大鼠脑出血后不同时间点脑源性神经生长因子（BDNF）表达的影响。方法选用Wistar大鼠复制脑出血大鼠模型，观察不同剂量破血化瘀填精补髓方剂改善脑出血大鼠神经功能缺损的作用，及出血后不同时间点神经营养因子BDNF表达情况。结果在给药第1、3、7日，脑出血损伤增加损伤区域内的BDNF阳性细胞数量；而且在损伤的第3日因损伤刺激出现的BDNF阳性细胞数量达到高峰，第7日已经开始回落。应用破血化瘀填精补髓方剂干预后，可以延长BDNF阳性细胞数量达到高峰的时间。结论破血化瘀填精补髓方剂能明显改善脑出血大鼠神经功能缺损；其作用机制可能与上调脑出血血肿周围损伤组织中BDNF表达有关。

脑出血神经营养因子破血化瘀填精补髓方剂

出血性中风的病死率、病残率均居脑血管病之首［1］。而脑出血后的脑组织继发损伤及其治疗一直被人们所关注。脑源性神经生长因子（BDNF）是脑内分布最广的神经营养因子。其对神经元的存活、分化、生长发育起到重要作用，并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进NSC的增殖、分化等生物效应。本研究观察破血化瘀填精补髓方剂对实验性脑出血大鼠神经系统体征及神经功能缺损评分的影响，同时检测出血后不同时间点神经营养因子蛋白表达变化，探索破血化瘀填精补髓方剂对实验性脑出血大鼠脑出血损伤修复的机制。

1　材料与方法

1.1实验动物实验所需的全部动物为清洁级的Wistar大鼠（由吉林大学实验动物中心提供），均随机选取谱系纯正、健康的，体质量控制在250～320 g，雌性雄性各半，总计126只。

1.2实验药物破血化瘀填精补髓方剂，组成：石菖蒲15 g，全瓜蒌20 g，烫水蛭8 g，生大黄10 g，蒲黄15 g，龟板胶10 g，虻虫5 g，三七10 g。将药物常规浸泡30 min后煎煮，每剂煎煮3次，将3次煎煮的药物混和在一起，去渣后将药液进行浓缩，约为95 mL，放入4℃冰箱中备用。定时取出重新煎煮浓缩，使1 mL药液中含有生药1 g（实验药物均由长春中医药大学第一附属医院中药实验室提供）。对照药物为醒脑健神胶囊（批号：921116，长春中医药大学第一附属医院制剂室）。

1.3仪器与试剂电热恒温培养箱JC303A-T型（成都一恒科技有限公司）；高压灭菌锅（杭州亚旭生物科技有限公司）；电热鼓风干燥箱DGX-8243B型（杭州汇尔仪器设备有限公司）生物组织包埋机BMJ-1（天津航空机电有限公司）；电热恒温水浴箱（杭州蓝天化验仪器厂）；大鼠脑立体定位仪（美国STOELTING公司）；组织切片机（德国施利精密技术公司）；图像分析系统（美国Image-Pro Plus）PV-6000免疫组化二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；DAB试剂盒（浓缩型）（北京中杉金桥生物技术有限公司）

1.4给药与分组按照随机原则，将126只大鼠随机分成空白组、假手术组、脑出血模型组和破血化瘀填精补髓方剂高、中、低剂量组及对照组，每组中再分出1、3、7 d 3个亚组，每个亚组各6只。假手术组按照1.0 mL/100 g体质量灌胃0.9%氯化钠注射液；脑出血模型组按照1.0 mL/100 g体质量0.9%氯化钠注射液灌胃；空白组给予常规普通饲料饲养；对照组将对照药物溶于2 mL水中，按照30 mg/100 g体质量灌胃中药汤剂；给药均为每日1次。破血化瘀填精补髓方剂组大鼠用药按正常临床患者每日所需的用药量与体质量折算系数比，计算出相当于低、中、高剂量的用药量（0.5 mL/ 100 g，1次/d；1.0 mL/100 g，1次/d；1.0 mL/100 g，2次/d）。

1.5模型制备参考文献［2-3］报道方法，大鼠脑出血模型的建立采用10%水合氯醛（320 mg/kg体质量），由腹腔注射进行麻醉；将大鼠固定在鼠脑立体定位仪上，常规消毒，用手术刀切开大鼠头部正中皮肤备用；将大鼠尾根部进行常规消毒，抽取50 μL鼠尾动脉血备用；将50 μL大鼠尾动脉血注入目标出血区，用骨蜡填补钻孔，缝合大鼠头顶及腹侧尾根部刀口。建立模型后将大鼠放回标记完毕组别的鼠笼中饲养。以上全部操作均严格按照无菌操作规程下操作。假手术组操作方法同上，但不向脑内注血。

1.6神经功能评分方法大鼠神经功能评分采用Longa法［4］，0分：无明显的神经功能缺损。1分：提尾实验结果呈阳性，即前肢出现屈曲状态，但不伴随其他的不正常反应。2分：侧向推力实验结果呈阳性，即侧推抵抗力有下降，同时伴随前肢屈曲状态，但没有自由行动时自发性旋转的行为。3分：提尾实验和侧向推力实验结果均呈阳性，且伴随自由行动时自发性旋转，向瘫痪侧划圈。

1.7标本采集与检测分别于1、3、7 d时间点处死大鼠取脑，然后在切面鼠脑的后侧取厚度约为5.0 mm的脑组织留作备用。组织固定，梯度脱水，石蜡包埋，切片机切片，进行常规苏木精-伊红染色及免疫组织化学技术染色。将脑组织切片放在光学显微镜下观察，随机连续选取出血灶边缘5个视野，应用显微图像采集系统对所观察的镜下图像进行分析，记录每个视野范围内的阳性细胞的数目。

1.8统计学处理应用SPSS16.0统计软件检验。计量资料以（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠神经功能缺损程度评分见表1。研究结果表明与假手术组大鼠比较，模型组大鼠因脑出血影响，神经功能明显障碍，一般状况差，大鼠的进食量明显减少，出现消瘦，体质量减轻，毛色灰暗无光泽。对照组和破血化瘀填精补髓方剂高、中、低剂量组大鼠在给药3 d和7 d后与模型组大鼠比较，上述症状明显改善。与假手术组大鼠比较，模型组大鼠出现明显的神经功能障碍体征，出现偏瘫症状，左侧肢体废用，以前肢为重，行走呈顺钟向追尾状。与模型组大鼠比较，对照组和破血化瘀填精补髓方剂高、中剂量组大鼠在给药3 d和7 d后上述症状明显改善（P＜0.05或P＜0.01）。

表1　各组大鼠神经功能缺损程度评分比较（n=6，分，±s）

表1　各组大鼠神经功能缺损程度评分比较（n=6，分，±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

组别1 d3 d7 d假手术组000模型组1.50±0.273.51±0.410.67±0.11对照组1.32±0.322.67±0.29*0.57±0.08**低剂量组1.41±0.312.59±0.27*0.25±0.09**中剂量组1.33±0.212.15±0.67**0.16±0.7**高剂量组1.31±0.121.88±0.36**0**

2.2BDNF免疫组织化学染色结果见表2和图1。研究结果表明在给药第1日，与假手术组比较，模型组BDNF阳性细胞数无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，对照组和破血化瘀填精补髓方剂低、中、高剂量组BDNF阳性细胞数同样差异无统计学意义（P＞0.05）。第3日，与假手术组比较，模型组BDNF阳性细胞数明显增高（P＜0.01）。与模型组比较，对照组和低剂量组BDNF阳性细胞数同样略有增高，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。高剂量组及中剂量组BDNF阳性细胞数明显增高，与模型组比较具有显著的统计学意义（均P＜0.05）。第7日，与假手术组比较，模型组BDNF阳性细胞数目明显增高，有显著的统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，对照组BDNF阳性细胞数明显增高（P＜0.01）；低剂量组BDNF阳性细胞数略有增高，无有统计学意义（P＞0.05）。中剂量组及高剂量组BDNF阳性细胞数明显增高，与模型组比较具差异明显（均P＜0.01）。低、中、高剂量组大鼠BDNF阳性细胞数目在术后第1日，第3日和第7日，随时间变化有显著的变化，与第1日比较，第3日和第7日BDNF阳性细胞数目明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各组大鼠BDNF阳性细胞数比较（n=6，±s）

表2　各组大鼠BDNF阳性细胞数比较（n=6，±s）

组别1 d3 d7 d假手术组32.09±4.8232.3±6.38**31.43±6.79**模型组1.50±0.2765.26±8.660.18±6.35对照组47.41±5.7370.03±5.9485.79±6.35**低剂量组49.65±5.9465.51±6.3573.26±7.16中剂量组56.92±5.1174.2±6.55*84.19±7.57**高剂量组55.99±5.9479±5.73*85.24±8.4**

图1　各组大鼠第7日BDNF蛋白表达情况

3　讨论

中医学认为，出血性中风其病位在脑。脑是人体的重要器官，外为头面，内为脑髓，在人体的生命活动中起着重要的作用。“脑为髓之海，属奇恒之腑”，这是早在《内经》时期就已明确指出的，同时，这也是“脑髓学说”形成的早期的理论基础［5］。中医经过后世的不断发展完善，逐渐形成了独特的脑髓理论学说。据此，笔者提出了“瘀阻脉络，髓虚毒损”的出血性中风的新病机学说。其中髓虚毒损贯穿疾病始终；瘀是中风发病的基本病理基础。同时提出了“破血化瘀、填精补髓”的治疗总则。破血化瘀填精补髓方剂由水蛭、生大黄、生蒲黄、虻虫、瓜蒌、三七、石菖蒲、龟板胶组成。其中水蛭祛瘀血而不伤新血，破脑中血瘀；生大黄泄热、通下，推陈出新，给邪以出路，使邪速祛，共为君药。生蒲黄破瘀血、消水肿、和血脉；虻虫破残余之恶血，二药共助君药去瘀血以利生新血；瓜蒌清热通腑涤痰共为臣药。三七活血而兼止血之力，散瘀止血；石菖蒲辅君药、臣药理五脏，通九窍，醒脑以复神明；龟板胶血肉有情之品，滋阴、补血，以益受伤之脑髓，共为佐使药。诸药合用，共奏破血行瘀，消痰利水，泄热通经，填精补髄之效。

现代医学认为，脑出血最初的损伤是由于血肿扩大的机械性压迫所导致；血肿形成以后，凝血的连锁反应、毒性反应、炎症反应等等机制引起了脑组织的继发性损害，最终导致了神经元的坏死，灰质的损害，血管的损伤，血脑屏障的破坏及脑水肿［6-7］。因此，脑出血后的脑组织继发损伤及其治疗一直被人们所关注。近年来，基础研究［8］发现神经营养因子对维持神经元的存活“生长”分化以及损伤后修复与再生有着非常重要的作用，其中BDNF是较为重要的神经营养因子家族成员。BDNF广泛分布在人体各大系统组织中，但主要是在中枢神经系统表达，是脑内分布最广的神经营养因子。NSC增殖、分化需要许多神经营养因子的协同作用［9］。

本实验表明脑出血损伤增加损伤区域内的BDNF阳性细胞数量；而且在损伤的第3日因损伤刺激出现的BDNF阳性细胞数量达到高峰，第7日已经开始回落。而破血化瘀填精补髓方剂干预后，可以延长BDNF阳性细胞数量达到高峰的时间。因此破血化瘀填精补髓方剂可以通过增加损伤区域内的BDNF阳性细胞数量以及延长BDNF阳性细胞数量达到高峰的时间减少受损神经元的死亡、促进受损神经元的再生和分化、促进突触的可塑性、修复受损脑组织。

通过本实验研究的结果，进一步支持了中医“破血化瘀填精补髓”治法的治疗作用，进而使现代医学在治疗出血性中风上的理论基础得以拓宽，为基础临床治疗得以广泛地应用提供科学依据。

［1］吴江.神经病学［M］.北京：人民卫生出版社，2006：170.

［2］张昊，马晓依，吕妍，等.大鼠脑出血模型［J］.中国医药指南，2012，10（34）：88-89.

［3］田增有，孟令丽，杨莎莎，等.脑出血模型制作方法研究进展［J］.河北联合大学学报：医学版，2012，14（6）：809-810.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Rerersible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91.

［5］刘倩.脑出血的中西医结合研究进展（综述）［J］.中国中西医结合急救杂志，2008，15（6）：381-384.

［6］Nishino H，Hida H，Takei N，at al.Mesencephalic neural stem（progenitor）cells develop to dopaminergic neurons morestrongly in dopamine-depleted striatum than in intact striatum［J］.Exp Neurol，2000，164（1）：209-214.

［7］Harrower TP，Tyers P，Hooks Y，et al.Long-term survival andintegration of porcine expanded neural precursor cell grafts in a ratmodel of Parkinson’s disease［J］.Exp Neurol，2006，197（1）：56-69.

［8］Cui X，C hopp M，Shehadah A，et al.Therapeutic benefit of treatment of strnke with simvastatin and human umbilicalcord blood cells：neurogenesis，synaptic plasticity，and ax-on growth［J］.Cell Transplant，2012，21（5）：845-856.

［9］Nagahara AH，Tuszynski MH.Potential therapeutic uses of BDNF in neurological and psychiatric；disorders［J］.Nat Rev Drug Discov，2011，10（3）：209-219.

Effect of Poxuehuayutianjingbusui Decoction in the Expression of Neurotrophic Factor BDNF in Experimental ICH Rats

ZHANG Yidan，ZHAO Jianjun，JIN Xi，et al.The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine，Jilin，Changchun 130021，China

Objective：To investigate the Poxuehuayutianjingbusui Decoction on the expression of neurotrophic factor BDNF in rats with cerebral hemorrhage.Methods：Wistar，establishment of rat models with cerebral hemorrhage broken blood stasis，were used the Poxuehuayutianjingbusui Decoction.They were observed the improvment of hemorrhage rat neural function defect effect and the expression of bleeding at different time points after the neurotrophic factor BDNF.Results：In the administration of the 1 st，3 rd，7 th day，cerebral hemorrhage injury increased damage within the region the number of BDNF positive cells；and on the third day injury due to damage to stimulate the emergence of the number of BDNF positive cells reached the peak，seventh days have begun to fall. And the application of Poxuehuayutianjingbusui Decoction intervention can prolong the time of the amount of BDNF positive cells reached the peak of the it.Conclusion：Poxuehuayutianjingbusui Decoction can significantly improve the neurological function of rats with intracerebral hemorrhage related defects；the expression of BDNF damage tissue around the hematoma and its mechanism may be related to the upregulation of cerebral hemorrhage.

Cerebral hemorrhage；Neurotrophic factor；Poxuehuayutianjingbusui Decoction

R285.5

A

1004-745X（2015）01-0001-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.01.001

2014-09-20）

国家中医药管理局中风病破血化瘀重点研究室项目