miRNA在骨科疾病中的研究进展

杜勇军等

【关键词】 微小RNA；骨肉瘤；骨性关节炎；骨质疏松症；类风湿性关节炎

中图分类号：R68 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.05.025

miRNA是近些年来研究的一大热题。它是在进化上具有高保守性的非编码蛋白序列，多在真核生物及病毒中被发现。其主要是通过与靶向信使RNA特异性结合，产生译翻译抑制和RNA降解。它参与生物体内多种调控途径且与多种疾病的发生机制有着密切的联系，如肿瘤的发生、感染性疾病、自身免疫性疾病及心脑血管疾病等。miRNA的发现对分子生物学领域的发展有重要意义，并对多种疾病的基因靶向治疗提供了新的方向。本文以miRNA的生物学特性为基础，结合其在骨科疾病中的发生、发展中的研究进展展开综述。

1 miRNA的一般概述

1.1 miRNA的发现及合成

miRNA最早发现于1993年，Lee等人在秀丽丝虫中发现了miRNA家族中的第一个成员Lin4，开始并未吸引人们的目光，直到2000年，Reinhart等[1]在丝虫体内发现了另一个成员miRNAlet7，并提出其调控基因表达的作用可能是多种生物中所共存的机制这一学说。由此，miRNA的出现给学术界带来了又一大研究课题，不断有关于miRNA的发现、学说等浮现在人们眼前，最终科学家们在线虫、果蝇、哺乳动物、病毒等中发现了大量的此类RNA，并统一命名为miRNA。miRNA的合成是一个比较复杂的过程，其中需要多种酶的参与[2]。首先是在细胞核内，编码miRNA信息的基因通过RNA聚合酶Ⅱ转录成具有特殊发夹结构的primiRNA；其次在Drosha酶的微切割下形成具有茎环结构的miRNA前体，称为：premiRNA，长度60～70 nt，最终premiRNA转移到胞浆后在Dicer酶的作用下形成一个5端磷酸化、3端有2个游离核苷酸的不完全互补且不稳定的双链RNA分子，并迅速降解成为长度为21～25 nt的单链非编码的miRNA；最后由最终产物与靶基因结合来发挥基因调控作用。

1.2 miRNA的作用机制及检测技术

miRNA是在真核生物中发现的非编码蛋白、短序列且高保守的小分子RNA。成熟的miRNA通过与靶向mRNA的3非翻译区域结合来实现基因调控。根据其结合匹配程度不同可分为两种作用机制。一类是与靶向RNA完全或者近似完全配对，而发挥与siRNA类似的作用，引起靶mRNA的降解，从而抑制其翻译；另外一类是与靶向RNA不完全的互补配对时，miRNA主要通过抑制靶RNA翻译时的启动和延长阶段达到抑制翻译的作用。随着人类发现miRNA的重要功能后，其检测技术也有了突飞猛进的进步，如印迹技术、阵列杂交技术、反转录PCR（RTPCR）技术、电化学检测技术等[3]。其中最早使用的是印迹杂交技术（即nothern blotting），后来Chen等[4]将RTPCR技术引入到miRNA检测中，并可以实时定量，后续该技术逐渐发展成人们检测miRNA的最常用技术。

2 miRNA与骨科疾病的相关性

2.1 miRNA在骨肉瘤中的表达

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是指成骨间叶细胞所产生的原发恶性骨或软组织的恶性肿瘤，其发病率在原发性恶性肿瘤中占据首位，以成骨或骨样组织的梭形基质细胞为特征。多发于青少年，且男性多于女性，主要好发于干骺端，其中以股骨下段及胫骨上段多见，且可发生肺部转移，治疗起来比较棘手。早期治疗的预后较差，手术后5年存活率仅为5%～20%，而随着新型辅助化疗的出现，其5年存活率提升至60%～70%。但一旦肿瘤发生转移治疗起来相当困难，且预后非常不理想。故对OS的发病机制、治疗方案等研究仍需不断拓展。随着miRNA的出现，不少学者通过实验发现，miRNA在OS的发病及病情发展中有着密切的联系，这为OS的临床研究开辟了新的道路。

早在2009年就有文献报道[5]miRNA1及miRNA206基因的表达可促进骨骼肌细胞分化并能抑制横纹肌肉瘤的生长。而miRNA1可以抑制甲硫氨酸（MET）的表达，MET具有酪氨酸激酶活性，在多种癌症中均有表达并与调节蛋白有关，并发现在骨肉瘤的肿瘤细胞中miRNA1有着差异表达。研究发现[6]，miRNA21在骨肉瘤中的表达明显高于正常骨组织，其对骨肉瘤的诊断及判断预后有着重要的作用，研究同时发现miRNA21的表达与RECK蛋白有一定的相关性。miRNA21可能主要通过调控RECK蛋白的表达来调节骨肉瘤的入侵和转移。另有研究发现[7]，骨肉瘤病变组织中的miRNA34明显低表达，其主要通过与CDK6、E2F3、E2、Bcl2等靶点结合，从而抑制P53介导的G1抑制和凋亡。P53是一种抑癌基因，编码分子量为53 KDa的蛋白质，并由此得名，其可分为野生型和突变型，P53对细胞周期的调控主要通过下游基因WAF1实现，突变型P53不能激活其下游基因而产生P21WAF1，导致细胞周期停止在G1期，促进细胞异常增殖，从而导致肿瘤发生发展，而野生型P53的作用正好与突变型相反。Lulla等[8]在骨肉瘤细胞中通过RTPCR发现了22种与正常骨组织细胞相比异常表达的miRNA，其中高表达的有四种：miRNA135b、miRNA150、miRNA5425p和miRNA652，而miRNA135b、miRNA150早已被证实与肿瘤的发生有关。Won等[9]在骨肉瘤的标本中发现有10种miRNA的表达明显高于正常人，其中发现notch信号通道中的miRNA199b5p与OS的发病密切相关，并表示miRNA199b5p抑制剂可能会用于骨肉瘤的治疗。随着科技的进步，越来越多与OS相关的miRNA逐渐浮出水面，这无疑为其治疗提供了新的研究方向。

2.2 miRNA在骨性关节炎中的表达endprint

骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是关节外科较常见的老年性疾病，主要以关节软骨的平衡遭受破坏所致的慢性、渐进性的退行性关节病变为主，故又称退行性关节炎。OA的发病机制非常复杂，至今发现的主要发病因素有：遗传、年龄、体重、外伤、关节炎症、细胞因子等。诸多发病因素中，归根结底还是关节软骨的异常发育。而有报道显示miRNA在关节软骨细胞的发育与修复过程中有一定的表达规律，这无疑给骨性关节炎的研究者提供了另一广阔的探索空间。Miyaki等[10]通过基因敲除的方法建立miRNA140基因缺失的小鼠模型，诱导出了小鼠关节软骨呈现原发性骨性关节炎的改变，相反利用转基因技术使小鼠表达miRNA140，发现这些小鼠有抵抗抗原诱导性关节炎的能力。同时他们也发现了miRNA140基因敲除的小鼠软骨内成骨障碍，从而导致小鼠四肢短小及骨骼畸形等改变。有研究发现miRNA146α和miRNA22的表达与基质金属蛋白酶13的表达有一定联系，但具体表达水平尚不清楚，可见它们的表达与骨性关节炎的发生、发展也密不可分。随着研究的深入，miRNA140在骨性关节炎中的基因调控作用也逐步得到阐述。后续的研究[11]还发现，miRNA140基因的表达与聚蛋白多糖酶5（ADAMTS5）及金属基质蛋白酶13（MMP13）的表达水平有着直接的联系，且miRNA140基因表达减少时ADAMTS5及MMP13基因表达明显增高。而其他的研究也表明[12]，ADAMTS5及MMP13在OA患者的关节软骨细胞中的高表达是导致关节软骨基质降解的两种重要的水解酶。可见miRNA140基因的表达高低直接影响着软骨的生长与破坏水平。而另有研究发现[13]，在miRNA140基因敲除的小鼠实验中证实了miRNA140可抑制BMP信号通路，从而保持软骨细胞分化，这一现象与Dnpep的过度有关，而miRNA140基因缺失的小鼠Dnpep高表达导致BMP信号降低而使关节软骨被破坏。

2.3 miRNA在类风湿关节炎中的表达

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种全身性自身免疫性疾病，多为慢性起病，主要特征是关节滑膜的炎症。RA以侵犯多关节为主，呈多发性和对称性。主要病理特征是关节滑膜增厚合并大量炎症细胞浸润，血管翳形成及软骨组织的侵蚀与破坏[14]。随着RA的发展最终将导致关节强直畸形、功能障碍，甚至残废。RA属于一种自身免疫性疾病，影响其发生、发展和转归的因素较多。而近年大量研究发现miRNA基因的表达与多种自身免疫性疾病有关，并且可能参与调控RA的发病及疾病发展。研究发现[15]，miRNA146a在RA患者中的外周血单核细胞中表达明显高于正常人，且与RA患者疾病活动性相关的血沉、C反应蛋白、TNFα表达呈正相关，显然miRNA146a的表达水平与RA的发病有着直接联系。Stanczyk等[16]研究发现，miRNA203基因在RA患者中有促进炎症的发生和关节破坏的作用，主要是它在滑膜组织中的高表达引起MMP及IL6的产生增多，而MMP及IL6在RA的诊断中有着重要价值。Niederer等[17]研究发现，miRNA34的表达水平与RA患者滑膜成纤维样细胞的凋亡有着密切的联系，并通过实验证明miRNA34的表达水平上调可抑制滑膜成纤维样细胞的凋亡。而miRNA34主要是通过自身的高表达引起其靶蛋白X连锁凋亡抑制蛋白（Xlinked inhibito of apoptosis protein，XIAP） 的表达上调，并且XIAP的表达抑制RA患者滑膜成纤维样细胞的凋亡。荀春华等[18]通过定量PCR检测技术检测血浆及外周单个核细胞（PBMC）中四种miRNA（miR146a、miR223、miR16、miR155）的表达情况，结果发现在RA患者的PBMC中，四种miRNA的表达均上调。同时，还有研究发现[19]miR155高表达可抑制MMP1及MMP3的产生，从而对抗RA患者关节的破坏。

2.4 miRNA与骨质疏松症的相关性

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是多因素共同作用下导致成骨与破骨的平衡被打破后引起的以骨量减少，骨组织微细结构退化、破坏为主要特征的全身性代谢性骨髂疾病。在2009年国际骨质疏松症基金会上首次报告了亚洲人群的骨骼健康状况，并指出在中国骨质疏松的患者将逐年增长。OP多发于老年人，其导致骨骼的强度降低且脆性增高，从而导致骨折的高发，而骨折常常成为老年人致命的打击。目前人们对OP的认识仍有限，因而OP的发病机制、预防、治疗等方面的研究仍待深入。影响OP发生、发展的因素很多，如遗传因素、内分泌系统因素、营养状况、运动负荷等等。而近年来，人们的目光逐渐转移到微观环境中来，研究发现OP与miRNA在骨组织中的表达有一定的联系。多个miRNA参与了成骨细胞的分化成熟过程，如miRNA503、miRNA3960通过对破骨细胞和成骨细胞分化的相关基因表达的调控，在骨质疏松的发生过程中有着密切的联系[20]。而早在2008年LI等人[21]在BMP2诱导骨髓干细胞向成骨细胞分化过程中发现了有多种miRNA的参与，其中25个miRNA中有22个表达下调，且具体作用机制当时仍不清楚。Mizuno等[22]实验发现miRNA210在BMP4诱导骨髓基质细胞ST2 成骨分化过程中表达明显上调。后来另有研究发现[23]miRNA1423p基因的表达可抑制APC 基因的蛋白表达并且激活Wnt通路，从而增强hFOB1.19细胞向成骨细胞分化，可见miRNA1423p基因的表达量与成骨分化呈正相关。另外还发现miRNA29b、miRNA26a、miRNA30a5p、miRNA2861、miRNA20b等均有促进细胞成骨分化的作用。与此同时，也有研究发现许多miRNA在成骨过程中起着负调控的作用。老年女性绝经后OP患者的骨骼标本中的miRNA表达水平发生了明显的变化，miRNA214水平明显增高，且其表达与成骨呈负相关。研究发现[24]小鼠原代成骨细胞在体外矿化过程中发现了miRNA93的表达明显降低，且负调控成骨细胞体外矿化能力。Eskildsen等[25]研究发现miRNA138可抑制成骨，其主要是通过抑制FAKERK1/2信号通道，导致下游的Runx2和OSX的磷酸化作用降低，从而抑制成骨骨分化。endprint

3 小结

miRNA在人的体液、骨骼、肌肉等多种组织、器官中持续且稳定的存在，研究发现miRNA与多种疾病的发生、发展及治疗有着密切的关系，可作为多种疾病辅助诊断和判断预后的新标记物。而miRNA在骨科疾病中的过高或过低的表达，为我们提供了新的思路，虽然目前在骨肉瘤的研究中发现了许多重要的miRNA，但要在骨肉瘤的诊断、治疗上起到历史性变革作用的发现仍需继续深入研究。而在骨质疏松症的问题上，miRNA也表现颇为突出，研究发现了促进成骨细胞成骨分化的miRNA，这必将成为后期抗骨质疏松治疗的一个新的靶点。但至今仍没有很好的方法去早期诊断和排除骨质疏松症，所以还需要很多努力。同时miRNA在关节疾病中的重要作用也逐步得到阐释，它与OA患者的关节软骨平衡有着密切的联系，所以若能通过miRNA基因的调控解决软骨细胞的修复、再生等问题，这将为骨性关节炎、类风湿关节炎等患者送去佳音。笔者相信，通过人类的共同努力，在不久的未来，这些难题都将被一一攻克。

参 考 文 献

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（收稿日期：2015-08-18 修回日期：2015-10-22）

（编辑：潘明志）endprint