双藤痹痛凝胶对CIA大鼠外周血调节性T细胞的作用研究

严国鸿　江川　潘旭东

【摘 要】 目的：分析双藤痹痛凝胶对胶原免疫性关节炎大鼠外周CD+4CD+25FoxP3+Treg 细胞的调节作用。方法：Wistar大鼠50只，随机分成5组，分别为正常组、模型组、双藤痹痛凝胶高剂量组、中剂量组、低剂量组，胶原蛋白诱导大鼠关节炎，并采用流式细胞术检测大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg及酶联免疫吸附试验检测血清中IL-6表达水平。结果：与模型组比较，双藤痹痛凝胶高、低剂量组大鼠外周血CD+4CD+25 T细胞及CD+4CD+25FoxP3+Treg细胞水平显著升高，且高、中剂量组血清IL-6水平显著下降。结论：双藤痹痛凝胶治疗类风湿性关节炎可能通过上调外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg细胞表达水平，降低血清IL-6水平，从而恢复免疫耐受作用。

【关键词】 双藤痹痛凝胶剂；类风湿性关节炎；调节性T细胞

【中图分类号】R2855 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）23-0033-03

类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA），是一种慢性全身性自身免疫性疾病，属于中医学“痹证”范畴，临床常出现关节疼痛，肿胀，僵直，变形等症状，病情反复，严重影响患者的生活质量[1]。双藤痹痛凝胶为我院院内制剂双藤痹痛酊（批准文号： 闽药制 Z20110008） 的基础上研制而成的新型制剂，凝胶剂是一种以水溶性高分子化合物或亲水性物质为基质，与中药或中药提取物混合后，涂布于布上制成的外用贴剂，具有透气性好、载药量大、耐汗性强，可反复黏贴，不污染衣物，药物无致敏、无刺激性等副作用。前期临床及动物实验证实其具有抑制 CIA 模型大鼠足趾肿胀和关节组织病理学改变，降低其关节炎指数的作用[2]。近年的研究发现调节性T细胞的功能与数量对RA等自身免疫系统疾病的发生、发展具有重要的影响，特别是对CD+4CD+25FoxP3+Treg细胞的影响，它可能成为治疗类风湿性关节炎的新策略和途径，因此，本文旨在探讨双藤痹痛凝胶是否通过调节CD+4CD+25FoxP3+Treg细胞，而发挥抗RA的作用。

1 材料与仪器

11 动物 Wistar大鼠50只，雌雄各半，SPF级，体重（220±20） g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK（沪）2007-0005，均由福建中医药大学动物实验中心提供，动物适应性喂养1 周后开始试验。

12 药物与试剂 药物 双藤痹痛凝胶，由福建中医药大学药学院提供，每片（8cm×12cm） 含雷公藤甲素24659μg，含青藤碱15589mg；空白凝胶膏剂，由福建中医药大学药学院提供。试剂弗氏完全佐剂（chondrex公司，批号：7002），Ⅱ型胶原（chondrex公司，批号：2002-2）；APC-抗CD4 mAb（批号：551980）、PE-FoxP3 mAb（批号：560046）、IL-6酶联免疫吸附试验试剂盒（批号：F1567）均购于Bioscience公司，FITC-抗CD25 mAb（批号：553071）购于Biolegend公司，红细胞裂解液购自美国BD公司。

13 仪器 CS-1EAS型电子天平（北京市菲姆斯科技开发公司，精度01g）；TGL-16G台式离心机（上海仪分科学仪器有限公司）；InfiniteM200 Pro多功能酶标仪（TECAN）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）。

2 方法

21 大鼠CIA模型的建立[3-4] 取50只Wistar大鼠，随机分成五组，每组10只，用刮毛刀刮去大鼠背部毛，以供贴药。将弗氏完全佐剂（FAC）与2mg/mL的Ⅱ型胶原乳液等体积混合，制成1mg/ml的胶原乳剂，除正常组外，按每只大鼠02mL乳剂（含CⅡ02mg）于尾根部皮下注射造模。7d后强化1次，除正常组外，按每只大鼠01mL乳剂（含CⅡ01mg）于尾根部皮内注射造模。

22 实验分组及给药 除正常组外，其余各组（模型组、双藤痹痛凝胶膏剂高、中、低剂量组）动物初次免疫后次日起开始给药，将药物贴于大鼠背部后，并用医用胶布固定；每日给药1次，连续28d。其中模型组为空白凝胶膏剂，大小为2cm×3cm；高、中、低剂量给药组分别给于大小为1cm×3cm、2cm×3cm、3cm×3cm的双藤痹痛凝胶膏剂。

23 流式细胞术检测外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg 摘眼球取血，肝素抗凝收集；取血100μL，加入含有05μLCD4-FITC和25μL CD25-APC单克隆抗体的离心管中，室温避光孵育30min；加入1mL红细胞溶解液混匀，以1500r/min离心5min，弃其上清液；加入1mL透化缓冲液（1×），以1500r/min离心5min，以试管底部不见红色为度；弃其上清液，加固定/透化工作液500μL震匀，4℃下避光孵育12h（或过夜）。加流式染色缓冲液以1500r/min离心5min，清洗，于上述细胞悬液，加入含有1μL FoxP3-PE单克隆抗体（设IgG2α为同型对照）震匀，室温避光孵育30min，加流式染色缓冲液清洗，加01moL/L PBS调定至300μL，上流式细胞仪检测。

24 酶联免疫法检测血清IL-6表达水平 眼眶采血，1500rpm/min离心15min制备血清，待测上清液、标准品、检测抗体使用量均为100μL，参照试剂盒的说明书检测血清中IL-6的含量。

25 统计学分析 实验中的检测结果均以（x±s）表示，组间比较采用t检验，P<005表示差异具有统计学意义。

3 结果

31 外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg细胞水平 采用三色荧光法标记进行流式细胞术检测发现，与正常组比较，模型组大鼠外周血CD+4CD+25T细胞水平显著下降，CD+4CD+25T细胞中FoxP3+T表达明显下降（P<005或P<001），CD+4CD+25FoxP3-T和CD+4CD+25FoxP3+T表达水平明显明显升高（P<005或P<001）；与模型组比较，双藤痹痛凝胶高、低剂量组大鼠外周CD+4CD+25T细胞水平显著升高，同时CD+4CD+25T细胞中FoxP3+T表达水平明显升高，CD+4CD+25FoxP3+T表达水平显著下降（P<005或P<001）。而双藤痹痛凝胶中剂量组除了CD+4T细胞及CD+4CD+25FoxP3+T显著下降外（P<001），其余无明显变化。

32 大鼠血清中IL-6表达水平 与正常组比较，模型组的IL-6水平显著升高（P<001），双藤痹痛凝胶高、中剂量组与模型组比较，均能显著降低IL-6表达水平（P<005或P<001），而低剂量组无明显变化。

4 讨论

已有文献研究表明，CD+4CD+25T细胞的数量减少或者功能的异常可能是由于其参与了类风湿性关节炎等自身免疫系统疾病的发生[5]，而FoxP3（Forkhead boxP3，FoxP3）则是目前公认的CD+4CD+25T细胞特异性标志，其基因表达调控着免疫T细胞的产生和成熟，一旦CD+4CD+25FoxP3+Treg细胞表达下降，可能直接影响机体免疫耐受，最终导致自身免疫性疾病的发生[6]。因此，研究CD+4CD+25T细胞及其特异性标志物FoxP3，在类风湿性关节炎的治疗中具有重要的意义。

本实验结果表明，双藤痹痛凝胶在一定剂量下可降低CD+4T细胞水平，同时升高CD+4CD+25T细胞水平和CD+4CD+25T细胞中FoxP3+表达水平，降低IL-6水平。这可能就是前期研究发现，双藤痹痛凝胶具有抑制CIA模型大鼠足趾肿胀和关节组织病理学改变，降低其关节炎指数作用机制之一。

参考文献

[1]胡荫奇.风湿性疾病诊断治疗指南[M].1版.北京：中国协和医科大学出版社，2006：84.

[2]严国鸿，黄燕，李煌，等.双藤痹痛凝胶膏剂对胶原诱导性关节炎模型大鼠的作用[J].中药药理与临床，2014，01：119-121.

[3]郭应强，邱桐，曾昭洋，等.敦煌消痹定痛酊对胶原诱导性大鼠关节炎病理形态学的影响[J].中医儿科杂志，2007，3（1）：14-16.

[4]赵海梅，刘端勇，程绍民，等.Ⅱ型胶原蛋白对CIA大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+ T细胞的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2011，27（3）：290-291.

[5]MorganME， Sutmuller RPM， Witteveen HJ， et al. CD25+ cell depletion hastens the onset of severe disease in collagen-induced arthritis[J]. Arthritis Rheum， 2003， 48 （5）：1452-1460.

[6]Hori S， Nomura T， Sakaguchi S，et al. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3 [J]. Science， 2003， 299（5609）：1057-1061.

（编辑：梁志庆）