三种大鼠骨质疏松模型的比较研究

冯　佳，向　阳，夏　燕，陈安平，杨年安，龚书识，袁　林

（1. 风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，恩施 445000；

2.湖北民族学院附属民大医院，恩施 445000）

三种大鼠骨质疏松模型的比较研究

冯佳1，向阳1，夏燕1，陈安平1，杨年安1，龚书识2，袁林1

（1. 风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，恩施 445000；

2.湖北民族学院附属民大医院，恩施 445000）

目的观察和比较不同造模方法对大鼠骨质疏松模型特点的影响。方法选用6月龄的雌性SD大鼠40只，分为正常组、去势组、糖皮质激素组和维甲酸组。造模6周后，比较各组大鼠血清钙（Ca）、磷（P）、碱性磷酸酶（ALP）、骨密度和骨组织形态计量学参数的变化。结果与正常组相比，去势组及维甲酸组大鼠血清Ca降低，P、ALP增高，股骨骨密度、骨小梁厚度、数量均明显减少，骨小梁间距增大；糖皮质激素组与正常组相比，各参数无显著差异。结论去势骨质疏松模型造模成功。短期间断使用糖皮质激素对大鼠松质骨的影响不明显；大剂量维甲酸能使大鼠出现骨量减少，骨微结构发生改变，但其毒副作用较大。

骨质疏松（OP）； 去势（OVX）； 糖皮质激素（GC）； 维甲酸（RA）； 大鼠模型

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是由内分泌失调、某些药物的长期应用、营养、遗传等多因素所致，以骨量减少，骨组织微细结构破坏导致骨骼脆性增加和骨折危险性增加为特征的系统性全身性骨骼疾病［1］。我国骨质疏松患病率为16.1%，女性为19.9%，男性为11.2%，女性骨质疏松的发病率明显高于男性，而且随着年龄增长呈现升高趋势［2］。多年来， 为深入研究成骨与破骨平衡原理、骨丢失的病理生理机制，筛选防治骨丢失的药物， 已复制了许多动物模型。目前研究OP的常用动物模型制作方法有去势（Ovariectomy，OVX），糖皮质激素（glucocorticoid，GC）、维甲酸（retinoic acid，RA）诱导等。国家新药审批条例明确指出，欲申报抗OP新药，必须对不同OP动物模型均疗效明显。本实验对大鼠分别进行去势，糖皮质激素、维甲酸诱导，观察短期造模后大鼠血生化指标、股骨骨密度、骨组织形态学的改变及不同造模方法间的差异，以选择最佳的短期造模方法为目的，以服务于今后骨质疏松症的实验及临床研究。

1　材料与方法

1.1实验动物

SPF级6月龄雌性SD大鼠40只，体质量200 ±20 g，由武汉大学实验动物中心提供［SCXK（鄂）2008-0004］。

1.2实验药物

维A酸（维甲酸）片，国药准字H20083494，山东良福制药有限公司生产。醋酸泼尼松片，国药准字H33021207， 浙江仙居制药股份有限公司生产。

1.3实验仪器

切片机（RM2235， 德国）， 自动脱水机（TC-120S），电热恒温干燥箱（GZX-DH-40X45），恒温摊片烤片机（TK-21 8IV），双能X扫描骨密度仪DX A （Prodigy，美国），彩色数码照像系统（DP70，日本），荧光显微镜（BX50，日本），BECMAN-AU680全自动生化分析仪。

1.4实验方法

1.4.1实验动物分组与给药大鼠适应性喂养1周后，随机分为4组，即正常组、去势组、糖皮质激素组和维甲酸组各10只。正常组不作特殊处理（为对照组）； 去势组大鼠去除双侧卵巢； 糖皮质激素组， 灌胃给予醋酸泼尼松4.5 mg/kg， 每周2次（每周一及周四）； 维甲酸组， 灌胃给予维甲酸70 mg/kg，每日1次。实验时间6周。

1.4.2大鼠去势方法以体积分数10%水合氯醛， 按体质量0.35 mL/100 g腹腔麻醉，剪毛备皮，常规消毒，于肋弓下脊柱两侧1 cm处，切开皮肤，逐层分离脂肪、肌肉，进入腹腔，用眼科镊找到输卵管后，顺着输卵管找到梅花状的卵巢，结扎输卵管后，剪去卵巢，分层缝合肌肉、皮肤。按同样的方法去除大鼠对侧卵巢。术后3 d，青霉素（80×105U）肌肉注射0.1 mL/只。

1.4.3实验指标的检测

1.4.3.1血生化指标检测采用眼球取血，血清钙（Ca）、磷（P）、碱性磷酸酶（ALP）均采用全自动生化分析仪测定。

1.4.3.2骨密度测定取左侧股骨，清除周围软组织，生理盐水洗净，双能X线骨密度测量仪小动物软件测定各组大鼠股骨骨密度。

1.4.3.3骨组织形态学测定取大鼠右侧股骨下三分之一，置于体积分数10%甲醛溶液中固定24 h。使用EDTA脱钙液脱钙48 h，直至能用大头针无阻力插入股骨为止。将股骨放入自动脱水机中自动脱水、透明、浸蜡12 h。石蜡包埋，用切片机沿股骨矢状面切成5 μm薄片， 行HE染色。骨组织切片置于显微镜下， 彩色数码照像系统进行图像采集。1.4.3.4骨组织形态计量学参数测定使用Image-Pro Plus6.0图像分析系统分析所采集的图像，选择小梁排列整齐， 连续性好， 成网状连接， 相邻骨小梁间距较小， 宽度均匀。去势组骨小梁连续性破坏， 排列紊乱， 数量减少， 厚度变细， 游离断端增多， 骨小梁间距增大。糖皮质激素组骨小梁网状连接存在， 游离断端少， 厚度较均匀。维甲酸组骨小梁宽度较细，有少许游离断端， 相邻骨小梁间距大（图1A～D）。干骺板下5 mm作为测量指标范围，测量骨组织形态学静态参数：骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁间距（Tb.Sp）及骨小梁数量（Tb.N）。

表1　各组大鼠血生化指标Table 1　The blood biochemical items in each groups of rat

1.5统计学方法

2　结果

2.1一般情况

去势造模组大鼠体质量逐渐增加，反应迟钝，活动少懒动。糖皮质激素组大鼠灌胃过程中，体质量增加不明显，未出现明显异常举动及反应。维甲酸组大鼠灌胃过程中，进食减少，体质量减轻，精神萎靡，毛发稀疏无光泽，一周后眼、鼻出现血性分泌物。

2.2血清中Ca、P、ALP含量

与正常组相比，去势组大鼠血清中Ca降低、P增高（P＜0.05），血ALP含量明显增高（P＜0.01）。糖皮质激素组血Ca、P、ALP与正常组相比无显著差异（P＞0.05）。与正常组比较，维甲酸组大鼠血Ca降低，血P、ALP含量增高（P＜0.05）（表1）。

2.3骨密度

与正常组相比，去势组大鼠股骨骨密度明显减少（P＜0.01）； 糖皮质激素组较正常组股骨骨密度有所降低（P＞0.05）； 维甲酸组与正常组比较，骨密度减少（P＜0.05）（表2）。

骨组织HE染色光学显微镜下观察示: 正常组骨

表2　各组大鼠股骨双能X线骨密度测定Table 2　The bone mineral density in each groups of rat

图1　大鼠股骨骨小梁病理学观察Figure 1　Pathological observation on bone trabecula of rats

2.5骨组织形态计量学参数结果

去势组大鼠股骨骨小梁厚度、数量均比正常组明显减少（P＜0.01）， 骨小梁间距明显增大（P＜0.01）。糖皮质激素组与正常组相比， 各参数无显著差异（P＞0.05）。维甲酸组较正常组， 股骨骨小梁厚度、数量均减少， 骨小梁间距增大（P＜0.05）（表3）。

表3　各组大鼠股骨骨小梁厚度、骨小梁间距及骨小梁数量比较Table 3　The comparison among femoral trabecular bonethickness，spacing and number in each groups of rat

3　讨论

骨质疏松症是多因素相关的代谢性骨病，只有深入研究其发病机制才有可能找到确实有效的防治方法和手段。骨密度是诊断骨质疏松的金标准，最常用的检测方法是双能X线吸收法（DXA）［3］。骨小梁厚度、骨小梁间距和骨小梁数量是反映单位面积骨小梁结构特征的参数。通过松质骨静态学参数可以了解骨质疏松模型是否建立成功。骨代谢生化指标较病理变化早，一般在术后1～2.5个月就有明显变化，可作为反映早期骨量丢失的灵敏指标，有助于造模的预测性诊断［4］。将骨量、骨生化指标与骨组织形态学结合在一起，可全面反映骨病理生理及功能变化， 为合理评价骨质疏松提供理论依据。

自1969年Saville首次建立去卵巢骨质疏松模型，已成为研究绝经后骨质疏松的经典动物模型。雌激素水平下降，使破骨细胞活性增强，成骨细胞功能代偿性提高，骨吸收大于骨形成，造成松质骨骨量明显减少、微结构退化，以致强度下降、脆性增加。有研究［5］认为绝经后妇女血钙水平随年龄增加而减少，血磷随增龄而增加，可能与绝经之后雌激素降低有关。ALP是反映成骨细胞功能的重要标志，骨形成与其活性相关。本实验选用6月龄雌性大鼠，其骨代谢处于相对稳定阶段，去势后1月发现骨密度减少，骨组织形态学遭到破坏以及骨代谢生化指标的变化均可说明造模成功。

糖皮质激素长期、大量或持续使用可抑制成骨细胞活力， 使骨质形成发生障碍， 导致骨质疏松，是最常见的继发性骨质疏松症［6］。但对短期应用糖皮质激素的研究相对较少。本实验发现糖皮质激素组大鼠骨量、骨微结构以及血生化指标较正常组没有显著变化。骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量虽有降低的趋势，但还不足以发现其骨丢失情况。说明短期间断使用糖皮质激素，对大鼠松质骨的影响可能不明显，其具体机制还需要进一步研究。

维甲酸是维生素A的衍生物，是治疗白血病的一种重要药物，伴有骨质疏松等副作用。维甲酸可激活破骨细胞，促进骨吸收。本实验发现维甲酸组大鼠的骨量较正常大鼠减少，骨形态学参数（骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁间距）反映出骨小梁微观结构的变化，表现为骨小梁稀疏变细、相邻小梁间距增大。血Ca、P含量及ALP活性改变，说明大量应用维甲酸后，影响了成骨、破骨过程以及钙磷代谢。实验发现，大剂量使用维甲酸，10只实验大鼠死亡5只，致死率达50%，并且还出现眼、鼻血性分泌物等明显副作用。

绝经后与各种药物引起的骨质疏松是目前临床中最常见的骨质疏松症，但在体内的作用机制却不尽相同。去势大鼠是研究绝经后骨质疏松症的经典模型，造模过程较无创操作复杂，术后要特别注意防止感染。随着糖皮质激素的应用越来越广泛，并发的骨折严重影响了患者的生活质量，这反映了建立合适的动物模型进行相关基础研究的必要性。而短期间断使用糖皮质激素造模，对大鼠松质骨的影响可能不明显。大剂量维甲酸能使大鼠短期内出现骨量减少，骨微结构发生改变，但其毒副作用较大。三种大鼠骨质疏松模型各有其特点。本次实验发现去势骨质疏松造模方法较糖皮质激素及维甲酸造模方法，具有效率高、安全性好的优势。据此，作者建议：在骨质疏松的研究中，应深入了解各种模型的优缺点，根据研究目的和条件选择最佳的模型及检测指标。

［1］张波， 杨述华， 许伟华， 等. 骨质疏松症与骨关节炎关系及其最新治疗进展［J］. 中华关节外科杂志， 2012， 6（2）:324-328.

［2］沈彦明， 孙陈静， 尹彦亮.老年骨质疏松症防治研究进展［J］.现代预防医学， 2013， 40（9）:1757-1762.

［3］王键， 龚颜， 曾荣， 等. 去势雌性大鼠骨质疏松模型的研究［J］. 海南医学， 2013， 24（3）:424-426.

［4］虞惊涛， 马信龙， 马剑雄. 骨质疏松动物模型评价方法［J］.中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志， 2014， 7（1）: 66-70.

［5］赵玺， 赵文， 孙璟， 等. 骨代谢指标与骨关节炎及绝经后骨质疏松症的关系［J］.中国组织工程研究， 2014， 18（2）:245-250.

［6］张雅蓉， 唐舸， 刘杉， 等. 5种常用大鼠骨质疏松动物模型的特点［J］. 国际口腔医学杂志， 2013， 40（5）:629-633.

Comparative Study on Three Kinds of Osteoporosis Model in Rats

FENG Jia1， XIANG Yang1， XIA Yan1， CHEN An-ping1， YANG Nian-an1， GONG Shu-shi2， YUAN Lin1
（1. Hubei Provincial Key Laboratory of Occurrence and Intervention of Rhumatic Diseases，Enshi 445000， China；2. University Hospital of Hubei University for Nationalities， Enshi 445000， China）

ObjectiveTo observe and compare the effects of different modeling methodsof osteoporosis on rats. MethodsFemale SD rats at age of six months were divided into normal group，ovariectomized group， glucocorticoid group， and retinoic acid group. After 6 weeks， the changes of serum calcium， phosphorus， alkaline phosphatase and bone density， bone histomorphometry parameters were compared. ResultsCompared with normal group， the serum Ca in ovariectomized rats was decreased， serum P and ALP were increased， bone mineral density， trabecular thickness and trabecular number were decreased， and trabecular spacing was increased.The Glucocorticoid group compared with normal group， there was no significant difference in each parameters. Compared with the normal group， retinoic acid rat’s serum Ca was decreased， serum P and ALP were increased，bone mineral density， trabecular thickness and trabecularnumber were decreased， and trabecular spacing was increased. ConclusionThe osteoporotic model was successful.With the short-term intermittent use of glucocorticoid，effects on the cancellous bone in rats may not be obvious， large dose of retinoic acid can reduce bone mass of rats in short-term and change the bone micro structural， but it had obvious side effects.

Osteoporosis； Ovariectomy； Glucocorticoid； Retinoic Acid； Rat Model

Q95-33

A

1674-5817（2015）01-0052-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.01.011

2014-07-08

湖北民族学院校园项目（MY2011B008）； 湖北民族学院民大医院院内课题（2013-6）， 湖北医学领军人才培养工程专项经费资助

冯佳（1985-）， 女， 硕士， 主要从事风湿病方面的研究

袁林（1974-）， 男， 博士， 主要从事风湿病方面的研究， E-mail: linyuanchina@126.com