不同结扎血管夹在兔腹腔胆囊切除术中的应用

陈献花， 潘永明， 包一红， 胡　飞， 庞秀炳， 陈　亮， 朱科燕， 徐剑钦， 陈民利

（1. 浙江省医疗器械检验院，杭州 310018； 2. 浙江中医药大学动物实验研究中心， 杭州 310053；3. 浙江微度医疗器械有限公司， 东阳 322118）

不同结扎血管夹在兔腹腔胆囊切除术中的应用

陈献花1， 潘永明2， 包一红3， 胡飞1， 庞秀炳3， 陈亮2， 朱科燕2， 徐剑钦2， 陈民利2

（1. 浙江省医疗器械检验院，杭州 310018； 2. 浙江中医药大学动物实验研究中心， 杭州 310053；3. 浙江微度医疗器械有限公司， 东阳 322118）

目的观察不同结扎血管夹在腹腔胆囊切除术后的结扎效果、炎症反应以及在体内性能稳定情况，为临床应用研究提供参考。方法将36只日本大耳白兔分成3组，即正常对照组、试验组和同类产品对照（Hem-o-lok）组，每组12只，其中试验组和同类产品对照组分别用佳助结扎血管夹和Hem-o-lok结扎夹在开腹胆囊摘除术中夹闭胆囊管及胆囊动脉。分别在术后6、12个月时处死动物，观察结扎效果及结扎部位大体病变，并取血测定谷氨酰转移酶（GGT）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和肌酸激酶（CK）水平，同时取体内的结扎血管夹进行重量和特性粘度分析。结果术后试验组和同类产品对照组结扎夹均在体内结扎牢固，肝脏组织病理形态均无异常，未见出血或胆漏发生。与正常对照组比，试验组和同类产品对照组血清GGT水平在术后3 d、14 d以及CK水平在术后3 d均明显升高（P＜0.05，P＜0.01）； 此外，试验组TNF-α水平在术后3 d和2个月时显著降低，同类产品对照组TNF-α水平亦在术后6个月时显著降低（P＜0.05）； 但实验组血清GGT、TNF-α和CK水平与同类产品对照组比差异不显著（P＞0.05）； 与原样比较，体内植入6个月、12个月后试验组结扎血管夹和同类产品对照组Hem-o-lok结扎夹的重量和粘度均无明显变化（P＞0.05）。结论佳助结扎血管夹用于夹闭胆囊管和血管结扎是有效的，在体内性能稳定，其作用效果和安全性与Hem-o-lok结扎夹类似。

结扎血管夹； 胆囊摘除术； 兔； 胆囊动脉

腹腔镜胆囊切除术已成为当前胆囊外科切除的金标准， 为确保胆囊管和胆囊动脉的安全， 牢固结扎胆囊管和胆囊动脉是避免术后胆漏、出血的关键环节， 故结扎管腔的安全性、可靠性及其术后的反应性是当前腹腔镜外科关注的焦点。当前腹腔镜胆囊切除术中常采用钛夹、可吸收夹及聚合物的不可吸收止血夹来闭合血管和胆管。钛夹价格便宜， 但可能因夹闭不全而脱落或移位， 使其进入胆管引起胆管炎、梗阻或结石形成； 另外， 钛夹具有导电性， 若电凝器接触时会引起组织烧伤， 对影像学检查有潜在干扰等［1，2］。可吸收性止血夹虽安全性和可靠性好，但价格昂贵，最大只能夹闭10 mm宽的血管且不能夹闭组织束； 可降解的止血夹须在4 ℃左右冷藏。聚合物注塑的不可吸收止血夹不导电， 不会引起组织粘连或导致焦痂，可透X射线， 对CT、MRI等检查无辐射、无伪影， 具有广泛的实用性，使用效果和安全性已得到广泛认可［3-5］。我国在腹腔镜胆囊切除术中使用的不可吸收结扎血管夹以进口产品占据主导地位、价格昂贵。佳助结扎血管夹是由浙江微度医疗器械有限公司自主研制的新产品， 由人体不吸收的聚甲醛材料经一次注塑而成。本实验采用开腹手术下进行兔胆囊摘除术， 使用佳助结扎血管夹进行结扎， 初步观察评价结扎血管夹对兔胆囊管和胆囊动脉的结扎效果和炎症反应情况、以及在体内的性能稳定性， 并与同类产品进口Hem-o-lok结扎夹类比， 为进一步进行临床应用研究提供参考。

1　材料与方法

1.1实验动物

普通级日本大耳白兔36只， 体质量为2.0～2.5 kg，雌雄各半，来源于新昌大市聚镇欣健兔场［SCXK（浙）2010-0042］，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心普通级兔饲养室［SYXK（浙）2008- 0116］， 室内温度20～22 ℃， 相对湿度40%～70%， 饲喂全价营养颗粒饲料，自由饮水，12h/12h明暗交替。

1.2材料、试剂与仪器

佳助结扎血管夹（白色，WD-JZM型，批号：JY1004-1108001），浙江微度医疗器械有限公司研制；Hem-o-lok结扎夹（白色，L544240型，批号：01A1000481），美国威克公司生产；速眠新II注射液和鹿醒宁注射液均由吉林省华牧动物保健有限公司生产；盐酸氯胺酮注射液，由福建古田药业有限公司生产；γ-谷氨酰转肽酶（GGT）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；磷酸激酶（CK）试剂盒，购自上海申能德赛诊断技术有限公司；肿瘤坏死因子（TNF-α）ELISA检测试剂盒，购自杭州达文生物有限公司；DU 800紫外分光光度计，美国Beckman公司；7020全自动生化分析仪，日本日立公司；Varioskan Flash连续光谱酶标仪，芬兰Thermo Fisher 公司。

1.3实验方法

1.3.1分组和处理所有兔经适应性饲养1周后，空腹取耳中动脉血测定血液学和生化指标，经检测无异常后，按体质量随机分成3组，即正常对照组、试验（佳助）组和同类产品对照（Hem-o-lok）组，每组12只，雌雄各半，其中试验组和同类产品对照组均行胆囊摘除术，并分别使用佳助结扎血管夹和Hem-o-lok结扎夹夹闭胆囊管和胆囊动脉，在术后6个月和12个月时各组均处理6只；正常对照组不做任何损伤处理。

1.3.2兔胆囊摘除术及结扎血管夹的应用术前将实验兔禁食12 h后，采用2 mg/kg速眠新II注射液和5 mg/kg氯胺酮注射液混合肌肉注射麻醉，待麻醉效果满意后，仰卧固定于手术台，消毒铺巾并取前正中切口4 cm入腹。皮肤上拉肝脏暴露胆囊和胆囊三角，解剖胆囊三角并分离出胆囊管和胆囊动脉，在胆囊管及胆囊动脉的近心端和远心端使用结扎血管夹各1枚，切断后锐性剥离胆囊并切除（图1），观察出血和胆汁漏出情况。术毕，分两层缝合腹壁切口， 消毒， 肌注鹿醒宁注射液0.2 ml，观察其一般情况尚可后，送回饲养室，并连续3 d肌肉注射青霉素钠4×104U/只。

1.3.3一般情况及结扎部位观察试验期间观察各组动物的体质量、外观体征、行为活动、伤口愈合情况、粪便与尿液以及饮食、饮水等情况，并在术后6个月和12个月时处死实验兔，观察结扎部位的大体变化，同时术后12个月取结扎部位的肝脏组织， 10%中性甲醛固定， 脱水、透明包埋和石蜡切片， 行HE染色， 观察肝脏组织病变。

图1　实验兔胆囊管和胆囊动脉结扎示意图Figure 1　Gallbladder duct and gallbladder artery ligation schematic in rabbits

1.3.4血清GGT、TNF-α和CK水平的测定分别在术前、术后3 d、7 d、14 d、1个月、2个月、4个月、6个月、9个月和12个月，空腹取耳中动脉血2 ml，3 000 r/min离心10 min，分离血清，在DU 800紫外分光光度计和7020全自动生化分析仪上分别测定血清GGT和CK水平，并用EILISA法在Thermo Varioskan Flash连续光谱酶标仪上测定血清TNF-α水平。

1.3.5结扎血管夹重量和特性粘度分析术后6个月和12个月时处死动物后，取出结扎血管夹和Hem-o-lok结扎夹，进行称重和粘度分析测试，并与同批次的原样比较。重量分析方法如下: 将样品进行清洁处理后沥干表面水分，放入已经60 ℃真空烘至恒重的称量瓶（m0）中，于60℃真空烘干2 h后，取出冷却称重； 继续放入真空干燥箱于同样温度烘干1 h后，取出冷却称重；如此反复操作，直至恒重（m）。特性粘度分析，采用乌氏粘度计，一点法测算特性粘度（intrinsic viscosity，［η］），溶剂为六氟异丙醇，温度25±0.5℃。

2　结果

2.1术中结扎血管夹使用后的结扎效果

试验组和同类产品对照组兔从开腹至胆囊切除术结束的手术时间一般在20～30 min， 平均25 min。术中试验组和同类产品对照组实验兔均无出血、胆漏和积液渗透等并发症发生， 表明试验血管结扎夹的结扎止血效果与Hem-o-lok结扎夹的作用无差异。

2.2术后各组实验兔的一般情况观察 实验期间，正常对照组兔毛色光泽、精神行为活动良好，粪便呈球形或椭圆形，大小均匀且光润，呈黑褐色，尿液呈黄色，饮食良好、体质量持续增加；试验组和同类产品对照组均在术后3 d内食欲相对较差，体质量有所减轻，且部分实验兔粪便略有变细、小且干，但尿液、精神行为活动均未见明显变化，切口部位未见明显的感染化脓、裂开等发生； 术后7 d开始，实验兔食欲明显好转，饲料无剩余， 粪便和尿液亦未见异常，且在术后1～2个月开始试验组和同类产品对照组兔的体质量已与正常对照组相当。

图2　术后6个月、12个月后各组实验兔大体观察Figure 2　The changes of gross lesion in each group of rabbit at 6 and 12 months postoperation

2.3血管结扎夹结扎部位大体及肝脏病理学观察

大体观察显示，术后6个月和12个月时试验组和同类产品对照组实验兔的肝脏色泽均呈暗红色，与正常对照组无异，且各组其余脏器均未见明显的病理改变； 另外， 试验组和同类产品对照组兔在术后6个月和12个月后夹闭部位的结扎血管夹和Hem-o-lok结扎夹均被一层薄薄的外周纤维组织膜包裹， 切面呈白色， 未见淤血块形成， 夹闭部位相对较为牢固， 未见明显的移位或脱落（图2）。术后12个月肝脏组织病理学显示，正常对照组肝细胞排列整齐， 体积正常， 小叶结构完整； 试验组和同类产品对照组兔的肝脏病理学亦未见明显的异常改变（图3）。

图3　术后12个月各组实验兔肝脏组织病理学观察Figure 3　The pathological observation on liver tissue in each group of rabbit at 12 months postoperation

2.4各组血清GGT、TNF-α和CK水平的变化

正常对照组兔的血清GGT、TNF-α和CK水平均在一定范围内呈现不规则的小幅波动； 与正常对照组比， 试验组血清GGT水平在术后3 d、14 d时和CK水平在术后3 d均明显升高以及TNF-α水平在术后3 d、2个月时降低显著（P＜0.05， P＜0.01）； 同类产品对照组血清GGT水平在术后3 d、14 d时和CK水平在术后3 d均明显升高以及TNF-α水平亦在术后6个月时明显降低（P＜0.05，P＜0.01）； 但试验组血清GGT、TNF-α和CK水平与同类产品对照组比均差异不显著（P＞0.05）（图4）。

2.5结扎血管夹重量和粘度分析

在体内植入6个月和12个月后，与原样比较，试验组结扎血管夹和同类产品对照组Hem-o-lok结扎夹的重量和粘度均无明显变化（表1）。

图4　各组血清GGT、TNF-α和CK水平的变化Figure 4　The changes of serum GGT， TNF-α and CK levels in each group of rabbit

表1　各组结扎血管夹重量和粘度分析结果的变化Table 1　The changes of vascular ligating clips weight and its viscosity analysis result in each group

3　讨论

微创外科手术中尽量减少手术对病人的创伤是外科医生们所追求的共同目标。在腹腔镜胆囊切除术中，由于胆囊三角解剖不清，胆囊管粗大时使得处理十分困难，尽管有临床学者采取多种手段改良［6，7］，以求尽可能减少创伤，但效果尚不理想，其关键问题是胆囊管的结扎。同时由于钛夹不可伸缩性以及可吸收结扎血管夹的价格昂贵，且可吸收结扎血管夹的施夹器不能通过5 mm Trocar等等，均限制了这些产品在外科手术中应用。而本研究的中号结扎血管夹可容纳5～12 mm的组织，能完全满足临床胆囊三角的大束结扎， 并可承受800 mmHg的动脉压力，对于高血压患者也可安全使用。本结果显示，直至术后12个月实验兔体内的结扎血管夹仍能牢固夹闭胆囊管和胆囊动脉，均未发现结扎血管夹滑脱移位、出血或胆漏等并发症，同时术后实验兔的肝脏亦未见明显的病理改变；手术操作时间与Hem-o-lok结扎夹无明显差异，且可达到同样的效果，表明该结扎血管夹可应用于胆囊切除术中，其操作简单、方便，预后是安全、可靠的。此外，对在体内结扎6个月和12个月的结扎血管夹进行重量和粘度分析亦显示其重量和粘度与原样相比均未见明显的变化，其反应与同类产品对照Hem-o-lok结扎夹类似，进一步表明该结扎血管夹在体内的物理-化学性质比较稳定，未见明显的分子量衰减，确保结扎效果。

GGT作为一种糖蛋白，广泛存在于机体的肝、肾、脾、肠、心肌和脑等组织器官中，从胆道排泄，血清中的GGT主要来自于肝脏，可作为评估肝功能异常的辅助指标［8］。当肝细胞受损时，使肝脏合成GGT增高。本结果显示，在术后3～7 d试验组和同类产品对照组血清GGT含量均明显升高，而14 d后逐渐恢复并与正常对照组一样维持相同的变化趋势，故早期GGT升高与开腹胆囊切除术中对肝脏牵拉而引起轻微肝脏损伤有关，此后迅速恢复，这也与兔早期出现暂时性食欲下降和体质量减轻，在术后7 d开始有明显好转并呈正常的增长模式的反应是一致的，且其术后反应与同类产品对照Hem-o-lok结扎夹类似，均未出现动物死亡等现象发生；另外，结果也显示术后3 d实验兔的CK出现暂时性的升高，由于CK主要存在于骨骼肌、脑和心肌组织中，CK的含量与肌肉运动密切相关，而术后CK的暂时升高可能与手术引起的骨骼肌损伤或肌肉疲劳有一定的联系，并在阳性对照组亦有类似的表现，且此后与正常对照组比均无明显的差异，表明腹腔胆囊切除术后实验兔恢复较快，证实本文试验用结扎血管夹应用后对动物的精神、行为活动等一般体征不会产生明显的不适感，并对兔的肝功能、心肌酶代谢未造成明显的影响，表明该结扎血管夹的应用是可靠、安全的。TNF-α是由巨噬细胞和单核细胞分泌的一种重要的促炎细胞因子，也是炎症反应进程中最早出现的重要炎症介质之一，其广泛参与炎症病变的多种病理生理变化， 对炎症反应、粒细胞的生成和功能均有重要影响， 能导致热休克、低灌注， 还能介导中性粒细胞的迁移和活化。本结果显示， 试验组和同类产品对照组血清TNF-α水平前期均低于正常对照组， 提示实验兔术后未见明显的炎症反应加剧，这可能与手术过程中采用小剂量的氯胺酮麻醉有一定的联系， 有体外研究表明， 氯胺酮具有抑制炎性细胞因子的作用， 认为小剂量氯胺酮可以直接干预炎症反应［9］， 并在败血症动物也观察到可降低动物的死亡率以及减少TNF-α和IL-6的产生［10］， 而且直至整个实验后期亦未见明显的升高变化， 与正常对照组比均无明显差异，进一步表明试验组结扎血管夹在体内不会加剧炎性反应， 具有很好的组织相容性。

可见，本研究中试验组结扎血管夹能大束结扎胆囊管、胆囊动脉及周围组织，有利于缩短手术时间，避免了周围组织、肝脏胆管的撕拉和损伤，保证手术的安全性，有助于微创外科手术的优化，减少腹腔镜胆囊切除术后的不良反应，促进预后的恢复； 并且结扎血管夹在手术止血、安全性方面与Hem-o-lok结扎夹具有同样的效果，故应用于夹闭或结扎胆囊管和胆囊动脉是安全可靠的。

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Application of Different TypeVascular Ligating Clips on Laparoscopic Cholecystectomy in Rabbits

CHEN Xian-hua1， PAN Yong-ming2， BAO Yi-hong3， HU Fei1， PANG Xiu-bing3，CHEN Liang2， ZHU Ke-yan2， XU Jian-qin2， CHEN Min-li2
（1. Zhejiang Institute for the Control of Medical Device， Hangzhou 310018， China；2. Laboratory Animal Research Center， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China；3. Zhejiang Weidu Medical instrument Co.， Ltd.， Dongyang 322118， China）

ObjectiveTo provide an experimental basis for clinic application of vascular ligating clips on ligation effects， inflammation and its performance stability in vivo after cholecystectomy. Methods Thirty-six rabbits were divided into 3 groups， negative control group， experimental （Jiazhu） group and positive control （Hem-o-lok） group， 12 rabbits in each group. The gallbladder duct and gallbladder artery were closed by Jiazhu vascular ligating clips and Hem-o-lok clips in experimental group and positive control grouprespectively. Animals were euthanized at 6 and 12 months postoperation， the ligation effects and the gross lesion in ligation sites were observed， the serum GGT， TNF-α， CK levels and the vascular ligating clips weight as well as its intrinsic viscosity in vivo were also detected. Results The ligating clips were ligated firmly and no bleeding or bile leakage were found， and the pathological morphology of liver has also no abnormal in experimental group and positive control group. Compared with negtive control group， the serum GGT level in experimental group and Hem-o-lok group were significantly increased at 3 days and 14 days postoperation and CK level were also significantly increased at 3 days postoperation （P＜0.05， P＜0.01）. Furthermore， the TNF-α level was significantly decreased at 3 days and 2 months postoperation （P＜0.05）， and was also significantly decreased at 6 months postoperation in Hem-o-lok group （P＜0.05）. The serum GGT， TNF-α and CK levels were no significant differences between experimental group and Hem-o-lok group （P＞0.05）. Compared with original samples， the weight of ligating clips and its intrinsic viscosity in experimental group and Hem-o-lok group had no obvious changes after 6 and 12 months implanted （P＞0.05）. Conclusion It is effective for the ligation of gallbladder duct and gallbladder artery by Jiazhu vascular ligating clips， besides， its performance is stable in vivo. The Jiazhu vascular ligating clips are similar validity and securitywith Hem-o-lok clips.

Vascular ligating clips； Cholecystectomy； Rabbit； Gallbladder artery

R197-39Q95-33

A

1674-5817（2015）01-0046-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.01.010

2014-07-09

浙江省生物可降解医用材料工程技术研究中心项目（2011E10021）； 浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目

陈献花（1968-）， 女， 副研究员， 研究方向: 医疗器械生物学评价。E-mail: chenxh.hz@163.com

陈民利（1963-）， 女， 教授， 研究方向: 实验动物与比较医学。E-mail: minlichen01@aliyun.com