薏苡叶黑斑病病原菌分离鉴定和生物学特性的初步研究*

李雪玲，杨海艳，陈华红

(楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000)

薏苡 ［Coix lachrymajobi L.var.mayuen(Roman)Stapf］，禾本科草本植物。薏苡的营养价值很高，被列为防癌食品之一［1］。作为一种营养价值较高的粮食作物和药用植物，薏苡在全国各个地方都有广泛栽培。目前，对薏苡的研究主要集中在药用和保健方面的作用机理［2—6］、薏苡植株中的提取物及其药效［7—9］和抗癌方面［10—12］，而对薏苡栽培过程中病害的研究相对较少［13］。近几年来，随着薏苡经济价值的不断攀升，薏苡的栽培面积和栽培规模迅速扩大，导致薏苡黑斑病的发生非常严重，使薏苡的产量和质量都受到了很大的影响。为此，要防治薏苡黑斑病，首要的工作应对薏苡黑斑病病原菌进行分离鉴定，了解该菌的生长特性，以期对该病进行有效的防治。

1.材料和方法

1.1 病原菌的分离

薏苡黑斑病病叶采自云南省楚雄州元谋县，用组织分离法分离到一株真菌菌株，菌株编号为CX098。

1.2 病原菌形态学和分子生物学鉴定［14］

1.3 生物学特性研究［15，16］

1.3.1 不同碳源和氮源对菌落生长的影响

1.3.2 不同温度对菌落和分子孢子萌发的影响

1.3.3 不同pH对菌落和分子孢子萌发的影响

1.3.4 不同光照处理

1.4 不同杀菌剂对菌落生长的影响［17］

2.结果与结论

2.1 CX098病原菌的鉴定

2.1.1 形态学鉴定

该病害发病初期叶片中部出现黑色小斑点，随着时间的推移，叶片逐渐分布到整个叶片，严重时病斑相互汇合，使整个叶片枯萎掉落。在PDA培养基上，菌落边缘青绿色，最中心灰白色，圆形、规则，菌丝絮状，边缘整齐;背面褐色，菌落生长缓慢，28℃培养6 d后直径3.7cm (图1)。菌丝浅褐色到褐色，有隔。分生孢子梗短，简单，楔状，从菌丝侧面长出，近于无色，孢子梗长×宽为 (6.2～41)μm× (1.8～6.7)μm。分生孢子单生，顶生，大多为几个细胞 (多隔孢子或砖隔孢子);形状大多为宽椭圆形，长圆形到梨形或不规则形状大小3.6～16.3×2.1～8μm(平均12.6×4.2μm);分生孢子通常由分生孢子梗的壁破裂而分离 (图2，图3)。

图1 病原菌在PDA培养基上的菌落形态 (A:PDA培养基正面;B:PDA培养基背面)Fig.1 Conial morpholoy of pathogen on the PDA medium(A.The front of PDA medium;B.The back of PDA medium)

图2 病原菌分生孢子Fig.2 Conidia of pathogen

图3 病原菌分生孢子和分生孢子梗 (40倍镜下观察)Fig.3 Conidiophores and conidia of pathogen

2.1.2 病原菌rDNA—ITS序列分析

用BioEdit、Clustal x和MEGA 4.1软件采用NJ法进行系统分析，构建系统进化树 (图4)。结果表明与其遗传距离较近的有5个种，属内节点支持率为1.00，结合其形态特征的观察研究，初步判断供试菌株cx098为链格孢属真菌 (Alternaria sp.)。

图4 基于5.8S rDNA－ITS碱基序列构建的系统树Fig.4 Phylogenetic tree based on 5.8S rDNA －ITS sequence

2.2 CX098菌株对不同氮、碳源的利用

对供试的7种氮源和碳源CX098菌株均能利用。最适氮源和碳源分别是蛋白胨和葡萄糖。不同氮源和碳源对CX098菌株生长速度有显著影响 (表1)。

表1 不同氮源和炭源对菌株生长速度的影响Table 1 Effect of different nitrogen and carbon sources on the strain growth speed

2.3 CX098菌株在不同光照下的生长状况

全光照、黑暗处理与12 h光/暗交替处理差异极显著，其中12 h光/暗交替处理能促进菌落生长，全光照和黑暗处理菌丝生长相对较缓慢。分生孢子在有光或无光照条件下均能萌发 (表2)。

表2 不同光照对菌落和孢子萌发的影响Table 2 Effect of different light on colony and the spore germination

2.4 CX098菌株生长和孢子萌发在不同温度下的状况

试验结果表明，该病原菌在15～40℃范围内均能生长，最适菌株的生长温度和孢子萌发温度均为28℃。温度高于45℃菌丝和孢子均不能继续生长和萌发 (表3)。

表3 温度对菌落生长和孢子萌发的影响Table 3 Effect of temperature on mycelial growth and spore germination

2.5 不同pH对CX098菌落生长和孢子萌发的影响

试验结果表明，该菌生长最适宜的pH为pH6.0－7.0，与其他处理在5%水平存在显著差异。孢子适宜在微酸性环境下萌发，pH 6.0时孢子萌发率最高，pH 6.0时的孢子萌发率与pH 5.0、pH 7.0、pH 8.0时孢子萌发率在5%水平存在显著差异，与其他处理达到极显著差异 (表4)。

表4 pH对菌丝生长和孢子萌发的影响Table 4 Effect of pH on mycelial growth and spore germination

2.6 不同杀菌剂对CX098菌株的抑制作用

在供试的5种广谱杀菌剂处理条件下，CX098菌株的生长均受到抑制。抑制效果为扑海因＞代森锰锌＞百菌清＞恶霜锰锌＞敌克松。扑海因、代森锰锌的抑菌效果在5%差异水平与恶霜锰锌、百菌清达到差异显著，与敌克松达到极显著差异 (图5)。

图5 不同杀菌剂对菌丝生长的影响Fig.5 Effect of different getrmicides on mycelial growth

3.结论

真菌的系统发育和分类鉴定研究中广泛应用核酸序列及其结构基因的分析［18］。本文中薏苡叶片黑斑病病原菌的形态学特征观察与分子生物学分析结果相互吻合为链格孢属Alternaria sp.。供试的所有碳源和氮源均能被该菌利用，光暗交替利于该菌的菌丝生长，最高温度为28℃;光照和微酸环境利于分生孢子萌发，扑海因和代森锰锌对其生长有明显的抑制作用，可选用此类药剂防治由链格孢引起的薏苡黑斑病。

［1］陈宁，姜文婷，魏心元，等.黔薏苡1号干物质积累及生长发育动态研究 ［J］.种子，2013，32(8):85—87.

［2］Hsia S M，Kuo Y H，Chiang W，et al.Efects of adlay hull extracts on uterine contraction and Ca2+mobilization in the rat［J］.Ametican Journal of Physiology—Endocrinology and Metabolism ，2008，295:719—726.

［3］Kim S O，Yun S J，Jung B，et al.Hypolipidemic effects of crude extract of adlay seed(Coix lachrymajobi var.mayuen)in obesity rat fed hish fat diet:relations of TNF－a and leptin mRNA expressions and serum lipid levels［J］.Life Sciences，2004，75:1391—1404.

［4］Huang B W，Chiang M T，YaoH T，et al.The effect of adlay oil on plasma lipids，insulin and leptin in rat［J］.Phytomedicine，2005，12:433—439.

［5］Yu F，Gao J，Zeng Y，et al.Inhibition of Coix seed extract on fatty acid synthase，a novel target for anticancer activity ［J］.Journal of Ethnophannacology，2008，119:252—258.

［6］Otsuka H，Hirai Y，Nagao T，et a1.Anti inflammatory activity of benzoxazinoides from roots of Coix lachrymajobi var.mayuen［J］.Journal of Natural Products，1988，51:74—79.

［7］Chen H J，Chung C P，Chiang W，et al.Anti－inflammatory effects and chemical study of a flavonoid－enriched fraction from adlay bran ［J］.Food Chemistry，201 l，l26:1741—1748.

［8］Hidaka Y，Kaneda T，Amino N，et al.Chinese medicine，Coix seeds increases peripheral cytotoxic T and NK cells［J］.Biotherapy，1992，5:201—203.

［9］Lee M Y，Lin H Y，Cheng F，et al.Isolation and characterization of new lactam compounds that inhibit lung and colon cancer cells from adlay(Coix lachrymaljobi L.var.mayuen Stapf bran ［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46:1933—1939.

［10］Ukita T.Tanimura A.Studies on the anti－tumor component in the seeds of Coix lachrymajobi L.var.mayuen Stapf:Iisolation and anti－tumor activity of coixenolide［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1961，9:43—46.

［11］李毓.薏苡仁配合放射治疗晚期鼻咽癌的远期疗效分析 ［J］.华夏医学，1998，l1(1):10—11.

［12］胡祖光，熊带水，吴棣华，等.薏苡仁脂对人鼻咽癌细胞克隆形成的影响 ［J］.中药药理与临床，2000，16(3):14—15.

［13］徐春金.宁化薏苡黑穗病的发生和防治 ［J］.福建农业科技，2013，5:49—50.

［14］方中达.植病研究方法 ［M］.北京:中国农业出版社，1998.

［15］陆家云.植物病原真菌学 ［M］.北京:中国农业出版社，2001.

［16］孙广宇，彭友良，李振歧，等.核苷酸序列分析在真菌系统学研究中的应用 ［J］.西北农林科技大学学报 (自然科学版)，2003，31(6):187—192.