云南野生粗网柄牛肝菌粗多糖提取工艺及抗氧化能力的研究*

王浩华，谢美华，2，宋信信

(1.楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000;2.云南省高校应用生物学重点实验室，云南 楚雄 675000)

粗网柄牛肝菌 (Boletus ornatipes Peck)属伞菌目、牛肝菌科、牛肝菌属，是一类外生菌根菌，夏秋季生于阔叶林中地上，群生或单生，广东、四川、江苏、安徽、云南等地都有分布［1］。食用菌多糖发展前景广阔，具有重大的开发利用价值，新型药物越来越多地应用于临床，绿色、天然、安全、高效的食用菌多糖必将成为探索和发掘功能性食品和新型药物制剂的重要领域之一［2—5］。牛肝菌作为肉质大型真菌目前开发广泛，粗网柄牛肝菌作为其中的组成成员具有很好的开发潜力。提取多糖的方法有微波、热水浸提、超声波超临界流体萃取，酶解法和酸碱法，这些方法各有优缺点。目前，对粗网柄牛肝菌多糖的提取方法还未见报道，本文采用正交试验法优选粗网柄牛肝菌多糖提取工艺，旨在为其的进一步开发利用提供一定的理论依据。

1.材料与方法

1.1 材料

采集云南省楚雄市阔叶林中的野生粗网柄牛肝菌子实体，用蒸馏水冲洗干净，切成片状放入白色瓷盘中，105℃烘干30min后90℃恒重24h之后取出研磨成粉状过40目筛。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的制备［6］

所得线性回归方程为y=0.0148x－0.0002，R2=0.9994。说明线性良好。

1.2.2 粗网柄牛肝菌真菌多糖的提取单因素试验

用电子天平准确称取三份0.5g粗网柄牛肝菌的子实体粉末放入三个烧杯中，编号A，B，C.往三个烧杯中加水30ml。将A放入微波炉中微波5min，B用热水浸提放提取2小时，C用超声波法20min。之后分别过滤，取滤液，加入活性炭除去色素，抽滤后取滤液用sevage法除蛋白质，进行离心，离心后取上层清液即为粗网柄牛肝菌粗多糖液。吸取A，B，C中的真菌多糖溶液用苯酚－硫酸比色法在490nm下测定其吸光度。

1.2.3 正交试验

通过单因素的试验结果设计三因素三水平正交试验 (表1)。

表1 因素与水平TableTable 1.factors and levels

1.2.4 最佳提取条件的验证试验

为了验证结果的稳定性，每组称取原料粉0.5g，每组试验3个重复进行多糖的提取。

1.2.5 粗网柄牛肝菌多糖抗氧化能力的研究，DPPH法［7—8］。

2.结果与分析

2.1 单因素试验结果

单因素试验结果表明，微波法提取的效果最好，与热水浸提法相比在5%水平显著差异，与超声波提取法相比在1%水平差异极显著 (表2)。

表2 单因素提取粗网柄牛肝菌多糖的结果Table 3 Result of Single factor methods on polysaccharides of Boletus ornatipes

2.2 正交试验结果

2.2.1 从试验结果得出，最佳提取方法是微波加热6min、1∶60的料液比、提取3次。极差分析结果表明，对粗网柄牛肝菌多糖得率的影响依次为料液比、微波时间、提取次数 (表3)。对粗网柄牛肝菌多糖得率有极显著影响的是不同的微波时间和料液比，不同提取次数对多糖得率影响不显著(表4)。

表3 粗网柄牛肝菌提取菌多糖正交试验结果Table 3 The results of orthogonal tests of Boletus ornatipes

表4 粗网柄牛肝菌提取菌粗多糖正交试验方差分析表Table 4 The table of variance analysis of Boletus ornatipes，polysaccharides

2.2.2 最佳提取条件的验证试验

验证试验粗多糖得率平均为32.62±0.67(mg/g)，说明试验工艺稳定性和重复性较好。

2.3 粗网柄牛肝菌粗多糖抗氧化能力的检测

粗网柄牛肝菌粗多糖质量浓度为0.25 mg/mL时的抑制率为96.06%，说明粗网柄牛肝菌粗多糖存在较强的抗氧化活性 (表5)。

表5 粗网柄牛肝菌粗多糖与Vc抗氧化抑制率比较Table 5 Antioxidant inhibitory rate of Boletus ornatipes，polysaccharides compared with Vc

3.讨论与结论

3.1 就三种提取方法来说微波法优于其他两种方法在料液比相同的情况下，微波提取方法的多糖得率是热水浸提法的1.12倍，是超声波法的1.4倍。这可能得益于高频率的电磁波能够较好的穿透入物体的深处，从而导致细胞破裂，胞内有效成分流出，从而容易进入提取溶剂。

3.2 选择微波法作正交试验，从正交试验结果得出最佳提取工艺为微波时间6min、料液比1∶60，提取次数3次，多糖得率高达31.93mg/g。从表6知道料液比和微波时间 (0.01＜P＜0.5)对粗网柄牛肝菌多糖的提取有极显著的影响，而提取次数 (P＜0.01)对其没有显著地影响，这是因为第一次提取就已经提取出大部分多糖，再多提取几次也只是获得了相当少的多糖，这一点对以后大规模工厂化生产多糖具有重要的参考价值，工厂可以参考这一点从而在最少提取次数，花费最少的人力、物力下获得最大多糖得率。而料液比和微波时间对获得多糖有显著的影响，所以要获得更高的多糖得率可以从料液比和微波时间选择上下功夫，探索出能获得最大多糖得率的最佳方法。

3.3 羟基自由基反应性极强，对机体的破坏作用最大，可以导致各种疾病的发生和机体的衰老，用云南野生菌粗网柄牛肝菌粗多糖进行抗氧化性试验得出，其粗多糖有抗氧化的能力，且在一定浓度范围内，粗网柄牛肝菌抗氧化的能力随着不同的浓度升高，其菌多糖抗氧化的能力是其药用价值的基础。可以考虑将粗网柄牛肝菌作为抗氧化剂应用于食品和保健食品。

3.4 测定多糖含量是根据在其生成物的最大吸收峰的吸光度值来定量测定的，野生菌所含色素会影响测定值的大小。多糖测定过程中，不同的脱色方法对多糖的测定的含量影响很大，陶美华的研究表明，过氧化氢的脱色效果比活性炭好，但是过氧化氢脱色会使多糖严重损失，这是得不偿失的。［8］所以本实验选活性炭作为脱色剂是科学的。

［1］张春霞，纪开萍，何明霞，等.暗褐网柄牛肝菌子实体营养成分分析［J］.云南大学学报(自然科学版)，2010，6:702—704.

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［7］李丽，刘质净，时东方，等.车前草中苯乙醇苷类化合物的抗氧化活性研究［J］.江苏农业科学，2010(1):275—277.

［8］陶美华，潘清灵，章卫民.药用真菌多糖含量测定方法研究［J］.中国食用菌，2005，24(5):37—38.