基于PCR－RFLP技术的苯硫脲尝味的群体遗传学分析*

王晓博，杨 丽

(内蒙古大学)

0 引言

苯硫脲(phenylthiocarbamide，PTC)是一种白色结晶状化合物，由于含有N－C=S基团，呈苦涩味［1］.人类对苯硫脲的尝味能力具有显著的遗传学特征［1］，人 PTC苦味的尝味能力由7号染色体上(7q35－7q36)的一种苦味味觉感受器基因TAS2R38决定，该等位基因符合孟德尔遗传性状，属于常染色体不完全显性遗传，可以采用阈值法测定苯硫脲的尝味敏感性［2－4］.绝大多数尝味者与味盲者的区别在于三处单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs).味盲者的PTC编码区有五个限制性内切酶Fnu4H1的识别位点(识别序列5＇－ GC↓NGC–3＇)，如果是尝味者，则其第785位SNP恰好形成了一个额外的Fnu4H1识别位点(GCTGC).因此可以利用这个SNP造成的限制性位点多态性，设计引物，克隆该基因，酶切电泳确定并验证基因型［5］.

1 调查对象与实验材料

1.1 调查对象

受试者为在校大学生，年龄为20～23岁，共120人，其中男生40人，女生80人.

1.2 实验材料

1.2.1 基因型检测材料

受试者用灭菌牙签刮取口腔上皮细胞，用于提取目的基因;PCR引物委托上海生工生物技术有限公司合成，预期扩增产物303bp;

上游引物:hPTC Forward5’－aactggcagaataaagatctcaatttat－3’

下游引物:hPTC Reverse5’－aacacaaaccatcacccctatttt－3’

1.2.2 试剂和工具酶

苯硫脲 (PTC)结晶，dNTPs，Tris碱，Na2EDTA·2H2O，蛋白酶K，溴化乙锭，琼脂糖，100 bp DNA ladder Marker，灭菌超纯水等，Taq DNA聚合酶，限制性内切酶Fnu4H1等.

1.3 方法

1.3.1 试剂的配制

称取苯硫脲结晶与超纯水制成浓度梯度依次为 1/1500、1/3000、1/6000、1/12000、1/24000、1/48000、 1/96000、 1/192000、 1/384000、1/768000、1/1536000、1/3072000、1/6144000 的14种PTC溶液，标号1～14，过滤灭菌;另取蒸馏水作为第15号液.

1.3.2 PTC 尝味能力的测定

用滴管滴3～4滴14号液于受试者舌根部，让其尝味，之后用蒸馏水做同样试验;受试者若不能准确鉴别两种溶液的味道，则用13号溶液重复试验，(按浓度递增以此类推)直至能明确鉴别出PTC的苦味为止;当受试者鉴别出某一号溶液时，用此号溶液重复尝味3次，若结果相同时，则记录此时的浓度等级号，若受试者直到1号液仍尝不出苦味，则其尝味浓度等级定为＜1号.

1.3.3 人口腔上皮细胞总DNA的提取

在1.5 mL灭菌离心管中加入200 μL缓冲液Chelex;受试者用无菌牙签轻刮口腔腮内侧，刮下来的细胞在缓冲液中漂洗;加2 μL蛋白酶K，盖盖颠倒混匀，56℃水浴30 min;冷却室温，涡旋振荡器涡旋振荡混匀10 s;离心机13200 rmp瞬时离心10 s;沸水浴中煮沸8 min;涡旋振荡器涡旋振荡混匀20 s，离心机13200 rpm离心3 min;基因组DNA于4℃保存备用.

1.3.4 PCR扩增PTC基因片段及检测

PCR产物4℃保存备用.将PTC基因PCR扩增产物电泳检测，在凝胶成像系统中拍照.1.3.5 PTC基因PCR产物酶切及电泳检测

将PTC基因PCR产物37℃恒温Fnu4H1酶切3h或过夜，酶切产物4℃保存备用.分别依次加入 100 bp DNA ladder Marker对照，10 μL PCR产物对照，电泳50 min;凝胶EB染色后，放入凝胶成像系统中拍照.

表1 120名学生PTC尝味能力测试结果

2 结果与分析

2.1 PTC尝味能力分布

120名学生PTC尝味阈值统计结果见表1，图1、图2为PTC尝味能力分布图.从图中可以看出，PTC尝味能力呈双峰分布，且双峰性十分明显，双峰间的谷底是6号溶液处，故确定第6号液为味盲界限.不能尝出6号溶液及以上(＜6)者为味盲，共检出 14人，味盲率为11.67%，其中不能尝出1号溶液的6人，占全部味盲总数的42.86%，峰值在 ＜1位置;能尝出6～14号浓度的为尝味者，共106人，占88.33%，阈值集中在7～9号浓度范围内，峰值在9号处.尝味者中以7号至10号为尝味者杂合体，检出101人;11～14号为纯合体，检出5人.尝味者平均尝味阈值(±SD)为7.900±1.6886.

图1 PTC尝味能力测试结果(按性别划分)

图2 PTC尝味能力测试结果(按地域划分)

2.2 性别与PTC尝味能力的关系

苯硫脲味盲基因存在于7号常染色体上，因此从理论上讲，男、女味盲率应该没有显著差异，但文献报道，女性味盲率高于男性［6－7］.在收集的资料中，从表1可以看出，40名男生中，尝味者34人，平均阈值为7.5500±1.0720;味盲者6人，占15%;80位女生中，尝味者72人，平均阈值为8.075±2.2460;味盲者 8 人，占 10%.女生味盲率(10%)较男生味盲率(15%)偏低，此现象的原因可能与男女两性舌部的解剖学差异相关，平均而言，女性比男性具有更多的蕈状味蕾、有更多的味孔，所以女性与男性相比对PTC苦味更加敏感［8－9］.此外，男女尝味者平均阈值的差异，经t检验，t=1.28 ＜2.5，无显著性差异.男女味盲率的差异经χ2检验，P＞0.05，也无显著意义.这说明，PTC味盲与性别的关系不大.

2.3 不同民族PTC尝味能力的测定

研究发现人类苯硫腺尝味多态性有种族及民族差异，国内曾报告过一些少数民族的群体资料［10］，不同民族人群甚至同一民族在不同地区对PTC的尝味能力不同［11］.笔者检测的120人中有蒙古族15人，女生14人，男生仅1人，PTC尝味能力分布域为7～10号液，分别为1，2，10，2人，平均阈值为8.8667 ±0.7180;味盲率为 0.汉族有105人，男生39人，女生66人.PTC尝味能力分布在1，2，5，6，7，8，9，10，11，13，分别为 6，1，3，4，30，10，39，7，4，1 人，平均阈值为7.7619 ±2.2362.味盲率为13.33%，经t检验，t=3.52 ＞2.5，平均阈值有显著性差异.味盲率差异极显著.由此初步可知，蒙古族和汉族PTC尝味能力有差别.笔者认为蒙古族起源的非均一性和历史上蒙、汉族长期的基因交流，可能是导致这种情况的重要原因［12］.但由于蒙古族样本容量太小，因此统计结果的可靠性有待进一步确认.

2.4 地理位置与PTC味盲的关系

据肖春杰［13］等报道，味盲基因在我国分布有明显规律，即华南地区味盲基因频率最低，而西北地区，尤其新疆北部地区的味盲基因频率最高，其差异幅度相当大.PTC尝味能力在不同地理位置分布见表1.120名大学生中，内蒙古籍学生(区内)有 72人，味盲者 13人，味盲率18.06%;省外的学生有48人，检出味盲者1人，味盲率2.08%;区内和区外的味盲率有显著的差异性，由于区外的同学均为东部，而内蒙古地处西部，因此，基本说明PTC味盲与地理位置有一定的关系，由于所取的样本容量太小，不能够有力的说明东部地区味盲率要远比西部地区低.

2.5 群体的甚因频率和基因型频率

由表型判断，群体共120人，基因型为TT的5人，Tt的为101人，tt的为14人.则群体的基因型频率为:

TT的频率为:P2=5/120×100%=4.17%

Tt的频率为:2pq=101/120×100%=84.17%

tt的频率为:q2=14/120 ×100%=11.66%

由此，T基因的基因频率为:P=f(T)=f(TT)+1/2f(Tt)=4.17%+84.17%/2=46.255%，t基因的基因频率为:q=1－P=1－46.255%=53.745%.

根据Hardy－Weinberg公式计算出隐性基因t的频率为

T基因的基因频率为p=1－q=1－34.15%=65.85%.

χ2值为 =0.17，自由度df=1，当p=0.05，查表得 χ2=3.84 ＞0.17，统计学认为在 5%显著水平上差异不显著，观察数与理论数无明显差异，即证明本群体处于遗传平衡，且味盲基因频率为34.15%，与郑连斌［14］等测定的内蒙古蒙、汉两族的PTC味盲基因频率接近，但略微偏高，但低于庄振西［15］等测定的蒙古族、汉族和朝鲜族青少年的味盲基因频率，更低于白人的基因频率.

2.6 PTC酶切电泳检测图谱分析

对照DNA ladder Marker的指示条带位置，查看PCR产物和酶切产物的泳道中各有几条带.PCR产物预期只有一条约300 bp的带.酶切产物中如果只有一条与PCR产物同样位置的带，说明是tt纯合体(303 bp);如果只有两条带，一条暗淡，在前方较远处(64 bp)，另一条明亮比PCR产物带稍靠前(238 bp)，说明是TT纯合体;如果有三条带，一条明亮、与PCR产物位置相同，另一条比PCR产物带稍靠前，还有一条暗淡、在前方较远处，则说明是Tt杂合体.下面仅展示部分PCR产物和酶切产物的电泳结果(如图3所示)，来验证前文PTC尝味的结果.所有对象的基因型都得到PCR－RFLP的验证，与由表型得到的结果基本一致.

图3 PCR产物(左)和酶切产物(右)的电泳结果

3 小结

该调查群体中，味盲基因(t)频率为0.3415，味盲率为11.67%，比我国平均味盲率8.28%高［16－17］，男女生味盲率分别为 15% 和 10%，二者比较差别无统计学意义，这说明，PTC味盲与性别的关系不大.但由于实验对象来自不同的地区，又属于不同的民族，通过计算得出PTC味盲与民族和地理位置有关.所有对象的基因型都得到PCR－RFLP的验证，与由表型得到的结果基本一致，这就排除了由尝味错误所产生的偶然误差，使结果更可靠.

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