红曲酸奶中乳酸菌变化情况研究

王智耀，肖昌贵，倪　莉，张　雯，陈智超，刘志彬*（福州大学 食品科学技术研究所，福建 福州 350108）

红曲酸奶中乳酸菌变化情况研究

王智耀，肖昌贵，倪莉，张雯，陈智超，刘志彬*
（福州大学 食品科学技术研究所，福建 福州 350108）

利用超声波浸提法提取红曲中的有效成分，将红曲水提取液与全脂奶粉混合发酵制成新型红曲酸奶。通过荧光原位杂交（FISH）技术跟踪发酵过程中乳酸菌含量的变化，结果表明：红曲酸奶中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌数量显著高于普通酸奶。发酵2 h时，红曲酸奶中保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌菌体数量分别为普通酸奶的2.63和2.24倍；发酵5 h时，发酵接近终点，红曲酸奶中保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌菌体数量分别为普通酸奶的2.29和2.75倍。红曲酸奶的保藏期可达15 d，乳酸菌数符合国家标准的要求。

乳酸菌；荧光原位杂交；红曲酸奶

红曲又名赤曲、丹曲、红米，常以籼稻、粳米为主要原料，接种红曲霉发酵后制成，具有消食活血、健脾燥胃的功效［1］。红曲除用于肉制品着色和腐乳等行业外，作为一种性能优良的糖化剂，也被广泛地应用在酿酒等饮品产业中，在食品领域占有重要的地位［2］。乳酸菌被认是乳制品中应用最为广泛的细菌［3］，大多数乳酸菌为革兰氏阳性杆菌或球菌。酸奶生产中常用嗜热链球菌（Streptococcus thermophi1us）和保加利亚乳杆菌（Lactobaci11us bu1garicus）作为混合发酵剂，接种到发酵基料中进行酸奶制作［4］。研究表明，红曲与酸奶结合后可改善乳酸菌发酵环境，促进发酵体系内乳酸菌的生长［7］，从而改变酸奶最终的风味及营养成分，提升其口感与品质。

荧光原位杂交（f1uorescenceinsituhybridization，FISH）技术可将荧光标记的特异性寡核苷酸探针与菌体细胞内的特异rRNA片段杂交，通过荧光的激发达到检测目的［8］。该方法的使用，不需对待测菌体进行提前培养，对不可培养的菌体，能快速且准确地测定其变化情况。本研究通过对红曲米提取物、混合发酵剂混合全脂奶粉作为发酵基料，制成新型红曲酸奶。结合荧光原位杂交（FISH）技术［9］，分析不同发酵时间乳酸菌含量变化，探讨红曲对乳酸菌生长的影响，为红曲酸奶的开发提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

全脂奶粉：光明乳业有限公司；红曲米：市售；酸奶浓缩冻干发酵剂（嗜热链球菌（Streptococcus thermophi1us）2×1011CFU/g、保加利亚乳杆菌（Lactobaci11us bu1garicus）5×1010CFU/g）：杜邦丹尼斯克公司；白砂糖：太古糖业（中国）有限公司。

草酸铵、番红、NaC1、KC1、Tris、HC1、乙二胺四乙酸、KH2PO4、K2HPO4等试剂均为国产分析纯：国药集团化学试剂有限公司；溶菌酶、多聚甲醛、去离子甲酰胺等：上海生工生物工程有限公司。

1.2仪器与设备

GTTP02500型0.2μm聚碳酸酯滤膜：默克密理博公司；2000S型荧光显微镜：日本尼康公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

荧光实验选用EUB338探针。探针的5’端上标记A1exa F1uor488染料，染料在蓝色激发波长下发出绿光，由上海生工合成。探针EUB338序列为GCTGCCTCCCGTAGGAGT （5’-3’），其中GC含量为66.67%，温度为61.86℃。

1.3方法

1.3.1红曲酸奶制备的工艺流程及操作要点

红曲米的前处理：红曲米经粉碎机磨碎并过80目筛，得到红曲米粉；在红曲米粉中加入蒸馏水，在超声装置中处理20 min，充分提取红曲米中的营养成分［10］；超声波处理后在室温条件下充分浸提2 h，浸提过程持续搅拌；将所得到的溶液进行过滤，即得红曲水提液。

发酵剂的制备：将嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌以1∶1的比例，接种到经过121℃、5 min灭菌处理后冷却的脱脂奶培养基中进行培养，全过程于无菌超净工作台操作。在37℃培养箱中培养24 h，以充分活化乳酸菌；培养后培养基置于4℃保存，待用［11］。

1.3.2红曲酸奶的发酵工艺

在质量分数为12%的全脂奶粉中，依次加入红曲水提液、8%的蔗糖以及0.1%的复合稳定剂，在无菌操作台内室温水化2 h，充分溶解，得到发酵液；将发酵液分装到灭菌瓶中，在90℃水浴保温5min；待发酵液冷却至37～43℃时，添加酸奶发酵剂，接种后不断搅拌2 min，使菌种均匀分布于灭菌瓶中；43℃恒温发酵，直至pH值为4.3～4.5，或滴定酸度在70～80°T；将灭菌瓶置于无菌操作台冷却至室温，移入4℃冰箱中后熟12～24 h，即得红曲酸奶［11］。

1.3.3荧光原位杂交法（FISH）实验

（1）荧光原位杂交实验流程

取样固定→酒精保存→细胞壁通透→探针杂交→制片→荧光镜检

（2）乳酸菌荧光镜片制备

取100 μL待测酸乳液，置于1.5 mL离心管中，在10 000 r/min下离心5 min，去上清，收集沉淀；往收集的沉淀中加入10 μL 1×磷酸盐缓冲液重悬，再加入30 μL 4%多聚甲醛，放入4℃冰箱静置固定1 h；1 h后由冰箱取出离心管加入40 μL无水乙醇，在-20℃冰箱中储存0.5 h以上；取8 μL上述菌液，加入42.5 μL 0.01 mo1/L Tris-HC1溶液和2.5 μL 20 mg/mL溶菌酶溶液，混合均匀；往离心管中加入20 μL 5×杂交液、22 μL去离子甲酰胺以及5 μL的EUB338探针（黑暗条件下加入，防止淬灭），轻轻重悬，置于46℃下杂交1 h；取杂交后的液体在0.2 μm聚碳酸酯滤膜上真空过滤，滴加12 μL抗荧光淬灭剂，封片。

（3）荧光镜检

将制得镜片置于荧光显微镜下进行观察，蓝色光激发荧光。随机选取荧光显微镜内观察5个视野，取其平均数，菌体细胞数按照下列公式计算：

其中，因实验选用过滤半径为8.4mm的聚碳酸酯滤膜，其过滤面积S=π×8 4002≈2.22×108μm2；观察的视野面积为118×89.2=1.05×104μm2。

1.3.4酸奶的保藏期实验

将4℃冰箱中装有制成红曲酸奶的无菌瓶取出，无菌条件下进行取样操作，完成乳酸菌荧光镜片制备。取样时间［12］分别为1 d、2 d、7 d、8 d、11 d、12 d、13 d、14 d，取样完成后将无菌瓶放回冰箱。

2　结果与分析

2.1FISH法观察发酵过程中的乳酸菌

采用荧光原位杂交（FISH）法跟踪酸奶发酵过程中的乳酸菌变化，跟踪时间分别为1 h、3 h、5 h，通过荧光镜检图片观察发酵过程中乳酸菌数的变化，结果见图1。

图1　酸奶发酵1 h、3 h、5 h乳酸菌数变化情况Fig.1 Change of lactic acid bacteria count of yogurt by fermentation for 1 h，3 h，5 h

图1荧光视野中存在的两种菌分别为长杆型保加利亚乳杆菌和球型嗜热链球菌。其中图1A、1C、1E为普通酸奶发酵1 h、3 h、5 h FISH图（稀释倍数分为10、50、500倍）；图1B、1D、1F为红曲酸奶发酵1 h、3 h、5 h FISH图（稀释倍数分为10、50、500倍）。由图1可知，随发酵时间的增加，两种酸奶中总乳酸菌数均呈上升趋势。

2.2两种酸奶发酵过程乳酸菌的变化对比

对发酵时间为0～6 h的普通酸奶和红曲酸奶中的乳酸菌进行计数，结果见表1、表2。

表1　普通酸奶中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的菌体细胞对数值Table 1 The colony count logarithm ofStreptococcus thermophilus andLactobacillus bulgaricusin normal yogurt

表2　红曲酸奶中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的菌体细胞对数值Table 2 The colony count logarithm ofStreptococcus thermophilus andLactobacillus bulgaricusin red kojic rice yogurt

综合表1和表2可知，发酵1 h时，两种酸奶所测定的菌数量基本不变。延滞期时，菌体的细胞数目变化缓慢，菌体分裂几乎处在一个停止的状态［13］，判断此时球菌和杆菌处于延滞期，几乎不生长。发酵2～3 h时，菌体细胞数目开始增加，此时嗜热链球菌的增长速率快于保加利亚乳杆菌，菌体细胞数目更多，该时期嗜热链球菌是主要的产酸菌株［14］，这一结果与郭本恒等［15］认为的球菌率先进入对数生长期的结论一致。

PUTTANANJAIAH M K H等［7］发现，红曲提取物可以激活和提高β-半乳糖苷酶的活性，使体系内乳糖转化为乳酸的速率增快，进而促进乳酸菌的生长。统计分析发酵过程中两种酸奶乳酸菌的菌量变化，发酵1 h时，两种酸奶的保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌数目基本相同，处于生长的延滞期。随着发酵时间的增加，红曲酸奶适应发酵环境所用的时间少，更早进入对数生长期，发酵2h时，红曲酸奶中保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌菌体数量分别为普通酸奶的2.63和2.24倍。发酵5 h时，红曲酸奶中保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌菌体数量分别为普通酸奶的2.29和2.75倍。发酵全程，红曲酸奶中保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌菌体数量均高于普通酸奶。

2.3红曲酸奶保藏期研究

分析统计红曲酸奶发酵期间乳酸菌含量变化，以探究其保藏期，结果见表3。

表3　红曲酸奶保藏期间乳酸菌变化情况Table 3 Changes of lactic acid bacteria in red kojic rice yogurt during shelf-life

从表3中可以看出，保藏期达15 d时，红曲酸奶中乳酸菌含量＞106CFU/mL，符合国家标准GB 19302—2010《发酵乳》对酸奶中活性乳酸菌含量的要求。因此可说明红曲酸奶保藏期可达15 d。

3　结论

应用荧光原位杂交（FISH）技术对酸奶中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行计数。结果表明，红曲酸奶中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌数量显著高于普通酸奶。当发酵2 h时，红曲酸奶中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的数量分别为普通酸奶的2.63和2.24倍；发酵进行至5 h，红曲酸奶中保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌菌体数量分别为普通酸奶的2.29和2.75倍。在发酵全部过程中，红曲酸奶中保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌菌体数量均多于普通酸奶，说明红曲米浸提液对乳酸菌的生长有一定的促进作用。经保藏15 d，红曲酸奶中乳酸菌含量＞106CFU/mL，满足国标相关要求，说明该红曲酸奶保藏期可达15 d。

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Changes of 1actic acid bacteria in red kojic rice yogurt

WANG Zhiyao，XIAO Changgui，NI Li，ZHANG Wen，CHEN Zhichao，LIU Zhibin* （Institute of Food Science and Techno1ogy，Fuzhou University，Fuzhou 350108，China）

The active ingredient of red kojic rice was extracted by u1trasound-assisted method and its water extract was mixed with who1e mi1k powder to ferment a nove1 red kojic rice yogurt.The changes of 1actic acid bacteria during the yogurt fermentation with or without red kojic rice extract were detected by f1uorescence in situ hybridization method.Resu1ts showed thatLactobaci11us bu1garicusandStreptococcus thermophi1uscount in red kojic rice yogurt was significant1y higher than that in norma1 yogurt，when the fermentation time was 2 h，the resu1ts indicated that the 1ogarithm numbers ofL.bu1garicusandS.thermophi1uscounts in red kojic rice yogurt were 2.63 and 2.24 times of norma1 yogurt，respective1y.When fermentation time was 5 h，the process was c1osed to the end，and the 1ogarithm numbers ofL.bu1garicusandS.thermophi1uscounts in red kojic rice yogurt were 2.29 and 2.75 times of those in the contro1，respective1y.The she1f 1ife of the red kojic rice yogurt cou1d reach 15 d and the 1actic acid bacteria count met the requirement of the nationa1 food safety standard of the fermented mi1k.

1actic acid bacteria；FISH；red kojic rice yogurt

TS201.3

A

0254-5071（2015）12-0020-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.005

2015-10-10

国家自然科学基金（31371820，31171733）

王智耀（1992-），男，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。

刘志彬（1982-），男，助理研究员，博士，研究方向为食品生物技术。