酱香型大曲中产淀粉酶菌的分离鉴定及发酵特性研究

毛　祥，黄　丹*，沈才萍，何开萍，钟方达，胡　峰（.四川理工学院生物工程学院，四川 自贡 64000；.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000；.贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州 习水 5646）

酱香型大曲中产淀粉酶菌的分离鉴定及发酵特性研究

毛祥1，黄丹1*，沈才萍2，何开萍3，钟方达3，胡峰3
（1.四川理工学院生物工程学院，四川 自贡 643000；2.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000；3.贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州 习水 564622）

对酱香型大曲中高产淀粉酶菌株进行分离鉴定，并对其产酶条件和代谢产物进行研究。结合形态学指标和16S rDNA同源序列分析对筛选获得的酱香型大曲中高产淀粉酶菌株进行鉴定，以小麦、麸皮浸提液为液体发酵培养基，研究培养温度、培养基pH值、摇床转速对其产淀粉酶能力的影响。结果显示，该分离菌株为枯草芽孢杆菌（Baci11us Subti1is），产酶最适条件为：培养温度50℃、初始pH值6.0、摇床转速为180 r/min，其酶活力达8 667.79 U/mL。

酱香型大曲；淀粉酶；枯草芽孢杆菌；发酵条件；代谢产物

中国传统白酒被称为世界六大蒸馏酒之一，其中酱香型白酒占有举足轻重的地位。酱香型白酒生产工艺独特，其中很重要的一点就是用曲量大，酱香型白酒酿造过程中，大曲用量占到酿酒原料的85%～95%，因此大曲质量与酱酒风味密切相关。酱香型大曲中有着种类繁多的酶系，它们可以将大分子营养物质分解成小分子物质被微生物所利用，有些会直接参与特有的风味物质形成，可见大曲酶系对酿酒的出酒率和成品的质量都有很大的影响［1-2］。淀粉酶降解制曲原料所产生的小分子糖类物质不仅是酿酒过程中各种微生物生长繁殖所需的碳源，而且小分子物质之间也会发生复杂的反应从而生成多种风味成分。可见淀粉酶活力作为浓香型大曲的一个重要质量指标，不仅跟淀粉质原料的水解程度有关，而且跟一些风味物质的合成密切相关，目前对酱香型大曲产淀粉酶菌株的研究，也大多局限于产淀粉酶菌株的筛选，淀粉酶酶学性质以及淀粉酶产生菌株发酵特性的研究等方面［3-5］。因此，本研究将从酱香型大曲中筛选得到一株高产淀粉酶的耐高温菌株，并优化产酶条件，在最佳产酶条件下，探究淀粉酶酶活与代谢产物之间的关系。本研究了解淀粉酶产生菌的代谢产物与菌株淀粉酶活力的相关性，有助于揭示酱香的形成机制，对提高酱香白酒品质具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

酱香型大曲：某著名酱香型酒厂提供。

筛选培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，可溶性淀粉2 g，NaC1 5 g，琼脂20 g，水1 000 mL。

种子培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，可溶性淀粉5 g，水1 000 mL。

液体发酵培养基按小麦∶麸皮∶水比例为4∶1∶40，于60℃浸润6 h，5 000 r/min离心15 min，取其上清液121℃高温湿热灭菌20 min。

蛋白胨、牛肉膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；可溶性淀粉、氯化钠、三氯乙酸（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；十二烷基磺酸钠（sodium dodecy1 su1fate，SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecy1 trimethy1 ammoniumbromide，CTAB）：上海索莱宝生物科技有限公司；聚合酶链式反应（po1ymerase chain reaction，PCR）扩增试剂盒：宝生物工程有限公司。

1.2仪器与设备

H752紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司；PHS-3C精密pH计：上海雷磁仪器厂；7890A GC/MS：美国安捷伦公司；HITACHI CR22G高速离心机：日本HITACHI公司；C9000 PCR仪：美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1酱香型大曲中淀粉酶产生菌的分离

称取25 g碾碎的大曲样品，加入至含有225 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，37℃、225 r/min振荡1 h。按稀释平板法将10-4、10-5、10-6三个稀释梯度样品处理液涂布于筛选培养基平板，37℃培养1 d，滴加碘液，观察产淀粉酶菌株菌落周围的透明圈，并测量透明圈直径（D）与菌落直径（d）之比。选择D/d值大的菌株进行纯化，纯化后，接种试管斜面低温保存备用。

1.3.2酱香型大曲中淀粉酶产生菌的筛选［6］

分离菌株的形态鉴定：观察各菌株菌落的形态、颜色以及菌落大小，并通过革兰氏染色和芽孢染色观察其个体形态，对筛选菌株进行初步的鉴定。

分离菌株的16S rDNA序列同源性分析鉴定：菌株16S rDNA提取：取2.0 mL的培养菌液12 000 r/min离心1 min；沉淀物加入500 μL的TE缓冲液重悬，加入30 μL 10%的SDS 65℃温浴1 h，再置于-80℃超低温冰箱放置15 min，后将离心管转移到65℃水浴锅放置15 min，如此重复3次，以促进细胞破裂。再于4℃、6 000 r/min离心10 min，转移上清液到2mL离心管中，加等体积苯酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1，V/V），剧烈振荡5 min，静置10 min后，13 000 r/min离心20 min。后将上层水相移入新的离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，室温沉淀1 h，13 000 r/min，离心20 min，弃上清，可见黑褐色沉淀。去除残余的异丙醇液体，加入1 000 μL体积分数70%乙醇，并转移至2 mL离心管内，静置10 min，4℃、13 000 r/min离心15 min，弃上清液，去除残余的乙醇液体，置于超净台吹风10 min，除尽乙醇，再入100 μL无菌水，置65℃水浴锅水浴1 h，促进DNA的溶解。

16S rDNA的PCR扩增及测序：PCR反应体系（50 μL）：5 μL 10×buffer，3 μL MgC12（25 mmo1/L），4 μL dNTPs （2.5 mmo1/L），1 μL引物Ⅰ（10 μmo1/L），1 μL引物Ⅱ（10 μmo1/L），1 μLTaq酶（5 U/μL），1 μL模板（100 mg/L），34 μL ddH2O。引物UP-1为GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，引物UP-2S为AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT，PCR扩增程序：94℃预变性5 min后进入35次循环94℃、1min，53℃、1min，72℃90s，72℃延伸10min。

数据分析：将扩增序列与NCBI数据库进行比对，找出与克隆子序列同源性最高的序列，用于构建系统发育树和确定其分类地位。DNA MAN软件对齐序列，Mega6.0软件的邻位法构建系统发育树。

1.3.3酱香型大曲中淀粉酶产生菌产酶条件研究

淀粉酶活性测定方法按照参考文献［7］：反应体系为5 mL 0.5%淀粉液中加入0.5 mL淀粉酶，在pH 6.0、40℃反应20min，加0.4 mo1/L三氯乙酸2 mL终止反应，取0.5 mL反应液，加入5 mL 0.4 mmo1/L卢戈氏碘液（KI-I2）溶液显色，波长620nm处测定光密度值。1个活力单位定义为20 min内水解1 mL淀粉液的酶量（U）。

不同培养条件对淀粉酶产生菌产酶能力的影响：50 mL液体培养基于250 mL锥形瓶，121℃灭菌20 min，种子液接种量5%（V/V），培养24 h，8 000 r/min离心发酵液10 min获得上清液，即粗淀粉酶液。培养温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃（自然pH、160 r/min），培养基初始pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0（50℃、160 r/min），摇床转速为120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min（pH 6.0、50℃）。

2　结果与分析

2.1酱香型大曲中高产淀粉酶菌株的分离筛选

用筛选培养基对产淀粉酶细菌进行稀释涂布分离，培养36 h后取出平板培养物滴加卢氏碘液，静置5 min待染色充分后，观察各菌落周围出现的透明圈大小，并测量D/d之比，初步判断该菌株产淀粉酶能力的强弱。挑选5株D/d比值大且菌落直径也比较大的菌落，分别编号为1#、2#、3#、4#、5#。对初筛得到的5株菌在37℃、160 r/min条件下产酶发酵培养24 h，分别测定其酶活力，进行复筛。菌株的筛选结果如表1所示。

由表1可知，1#菌株的酶活最大为6 004.50 U/mL。后续实验将选取产淀粉酶能力最强的1#菌为目的菌株。

各产淀粉酶菌株的菌落形态为圆形或椭圆形，质地疏松，乳白色，较湿润，表面光滑易挑取，边缘整齐。再对1#菌株进行革兰氏染色和芽孢染色，可知菌株呈杆状，有芽孢产生，革兰氏阳性菌，初步判断为革兰氏阳性芽孢杆菌［9］。

表1　菌落的初筛和复筛测定结果Table 1 Determination results of preliminarily screening and second screening

2.2菌株16S r DNA序列同源性分析鉴定［3］

提取1号菌株的16S rDNA，并通过PCR扩增和基因测序得知其序列，在将其扩增基因序列在NCBI数据库中搜索相似序列，构建系统发育树，系统发育树采用Neighbor-Joining法计算，Boottrap值为1 000次。如图1所示，1#菌株与Baci11us subti1is亲缘关系最近，相似度达99%，故1#菌株属于枯草芽孢杆菌，命名Baci11us subti1isHD-1。

图1　1#菌株基因系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene of strain1#

图3　初始pH值对菌株产酶能力的影响Fig.3 Effect of initial pH on enzyme activity

2.3淀粉酶产生菌最适产酶条件研究

2.3.1培养温度对产淀粉酶菌株产酶的影响

图2　培养温度对菌株产酶能力的影响Fig.2 Effect of culture temperature on enzyme activity

图4　摇床转速对菌株产酶能力的影响Fig.4 Effect of different rotation speed on enzyme activity

培养温度对菌株产酶能力的影响如图2所示。由图2可知，培养温度为30～50℃时，菌株代谢的酶活力随着温度的增加而增大；当培养温度高于50℃时，淀粉酶活力随着培养温度的升高而降低，这可能是高温抑制了菌体的生长繁殖，影响淀粉酶的产量，从而导致酶活力的降低。当培养温度为50℃时，该枯草芽孢杆菌的产淀粉酶活力最高，达7 536.43 U/mL。可见，Baci11us subti1isHD-1菌株产酶的最适温度为50℃。

2.3.2培养基初始pH对产淀粉酶菌株产酶的影响

培养基初始pH对菌株产酶能力的影响如图3所示。由图3可知，培养基pH在5.0～6.0时，1#菌株产生的淀粉酶的活力随pH的增加而增大，当培养基初始pH＞6.0时，1#菌株产生的淀粉酶的活力随pH的增加而增大而减小，因为培养环境的pH值对微生物生命活动的影响很大，主要是pH条件引起细胞膜两侧的电位变化，从而影响微生物对营养物质的吸收。在初始pH值为6.0时，产淀粉酶活力最高，达8 143.98 U/mL。因此，Baci11us subti1isHD-1菌株产酶的最适初始pH值为6.0。

2.3.3转速对产淀粉酶菌株产酶的影响

摇床转速对菌株产酶能力的影响如图4所示。由图4可知，摇床转速为120 r/min增至180 r/min时，该菌株的产酶能力逐渐增加。由于氧在水中的溶解度很低，增加摇床转速有利于增加水中氧的含量，从而增加菌株的繁殖和代谢，产酶能力增加。当摇床转速＞180 r/min后，该菌株产酶能力随摇床转速的增加而减小，可能是由于水中过多的氧气容易形成超氧化物基O2-和过氧化物基O22-，破坏细胞及细胞膜，影响菌体的生长繁殖从而降低菌株产酶能力。当摇床转速为180r/min时，菌株产淀粉酶的酶活力最高，达8667.79U/mL。可见，Baci11us subti1isHD-1菌株产酶的最适摇床转速为180 r/min。

3　结论

通过稀释平板法和平皿生化反应从酱香型大曲中分离筛选出产淀粉酶能力较强的5株菌株，再通过发酵产酶培养对挑选的5菌株进行发酵复筛，获得一株高产淀粉酶菌株，其酶活力达6 004.50 U/mL。经形态学鉴定和16S rDNA同源序列的鉴定，此菌株属于枯草芽孢杆菌（Baci11us subti1is）。

研究发酵温度、培养基pH值、供氧量对此菌株产淀粉酶能力的影响，最适培养条件为培养温度50℃、初始pH6.0、转速180 r/min，在此条件下菌株产淀粉酶的酶活力达8 667.79 U/mL。

［1］袁先铃，黄丹，刘达玉，等.酱香型大曲中蛋白酶产生菌的分离鉴定及产酶条件研究［J］.中国酿造，2012，31（6）：34-37.

［2］杨国华，邱树毅，黄永光.酱香白酒生产中产香微生物研究［J］.中国酿造，2011，30（4）：24-27.

［3］明红梅，刘宇驰，卓毓崇，等.制曲温度对酱香型大曲质量的影响［J］.中国酿造，2010，29（7）：157-160.

［4］张应莲，黄永光，邱树毅.酱香大曲中白地霉产蛋白酶固态发酵条件及其优化［J］.中国酿造，2012，31（3）：35-38.

［5］徐瑾，廖永红，徐嘉良，等.应用PCR技术分析酿酒微生物群落的研究展望［J］.食品与发酵工业，2015，36（2）：248-253.

［6］谢建华，师永生，杜丽琴，等.一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选、纯化及酶学性质［J］.应用与环境生物学报，2011（1）：95-99.

［7］史永昶，姜涌明.五种α-淀粉酶测活方法的比较研究［J］.微生物学通报，1996（6）：371-375.

［8］蒋丽婷，李理.HS-SPME结合GC-MS测定白腐乳中挥发性风味成分［J］.中国酿造，2011，30（3）：150-155.

［9］沈萍，陈向东.微生物学实验［M］.北京：高等教育出版社，2013.

［10］朱玉贤，李毅，等.现代分子生物学［M］.北京：高等教育出版社，2007.

［11］范文来，徐岩.酱香型白酒中呈酱香物质研究的回顾与展望［J］.酿酒，2012（3）：8-16.

［12］ZHU B F，XU Y.A feeding strategy for tetramethy1pyrazine production byBaci11us subti1isbased on the stimu1ating effect of ammonium phosphate［J］.Bioproc Biosyst Eng，2010，33（8）:953.

［13］ZHU B F，XU Y，FAN W L，et a1.High-yie1d fermentative preparation of tetramethy1pyrazine byBaci11ussp.using an endogenous precursor approach［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2010，37（2）:179-186.

［14］明红梅，余欢，周健，等.大曲中产香兼性厌氧细菌的筛选及挥发性成分分析［J］.食品与机械，2015（2）：7-10.

［15］赵德义，汤丹丹，曹建全，等.产四甲基吡嗪微生物菌株的选育［J］.中国酿造，2015，34（3）：102-106.

Iso1ation，identification and fermentation characteristics of amy1ase-producing strain from Moutai-f1avor Daqu

MAO Xiang1，HUANG Dan1*，SHEN Caiping2，HE Kaiping3，ZHONG Fangda3，HU Feng3
（1.Co11ege of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，China；2.Luzhou Laojiao Co.，Ltd.，Luzhou 646000，China；3.Guizhou Xijiu Co.，Ltd.，Xishui 564622，China）

The strain with high amy1ase-producing abi1ity were iso1ated from Moutai-f1avor Daqu，and the amy1ase-producing condition and metabo-1ites were studied.Combining with morpho1ogica1 indexes and 16S rDNA homo1ogous sequence ana1ysis，the iso1ated strain was identified.Using wheat and wheat bran extract as 1iquid fermentation medium，the effect of fermentation temperature，medium pH and rotation speed on amy1ase production capacity was studied.The resu1ts showed that the strain was identified asBaci11us subti1is，and the enzyme activity cou1d reach 8 667.79 U/m1 when the fermentation temperature was conducted at 40℃with pH va1ue of 6.0，rotation speed 180 r/min.

Moutai-f1avor Daqu；amy1ases；Baci11us subti1is；1iquid fermentation；metabo1ites

TS261.1

A

0254-5071（2015）12-0024-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.006

2015-10-26

四川省教育厅重点1项目（3ZA0124）；酿酒生物技术及应用四川省重点实验室项目（NJ2013-02）；泸州老窖科研奖学金项目（151jzk02）；四川理工学院研究生创新基金项目（y2014023）

毛祥（1989-），男，硕士研究生，研究方向为食品发酵生物技术。

黄丹（1968-），女，教授，本科，主要从事食品工程方面的教学和研究工作。