高耐受性醋酸菌的筛选及发酵特性研究

陈　洋，汪　超，高　冰，李冬生，徐　宁，胡　勇*（湖北工业大学 食品与制药学院，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 430068）

高耐受性醋酸菌的筛选及发酵特性研究

陈洋，汪超，高冰，李冬生，徐宁，胡勇*
（湖北工业大学 食品与制药学院，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 430068）

从工业醋醅中分离出5株耐乙醇、耐高温的产醋酸菌株，利用生理生化试验和16S rDNA同源序列分析，初步认定其为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）。通过对其耐乙醇、耐高温发酵特性的研究，发现菌株FY4可耐受体积分数为12%的乙醇和43℃高温，在30℃和体积分数10%乙醇条件下产酸量达到最高，为61.2 g/L。在10 L发酵罐试验中，菌株FY4的产酸量始终高于醋酸菌AS1.41，在37℃和体积分数10%乙醇条件下，菌株FY4产酸量达到42.2 g/L，而在此条件下工业菌株AS1.41几乎停止产酸。结果表明菌株FY4具有高耐受性，可产生大量的醋酸，在工业生产中具有潜在应用价值。

巴氏醋杆菌；耐高温；耐乙醇；筛选；深层发酵

醋酸杆菌属（Acetobacter）和葡萄糖氧化杆菌属（G1uconobocter）是较为常用的醋酸菌属，前者主要将酒精氧化为醋酸，用于酿醋工业，后者主要将葡萄糖氧化为葡萄糖酸［1-3］。醋酸菌不仅应用于生产葡萄糖酸、食醋、山梨酸，还是乙醇和糖类氧化的生化反应的最重要研究对象。目前，醋酸菌在维生素C制造工业、食醋酿造工业上都发挥着重要作用［4-5］。

醋酸菌是酿醋工业的核心菌种。在酿醋工业中，最常用的醋酸菌是醋杆菌属（Acetobacteer），如菌种AS1.41广泛用于中国工业醋酸发酵，其适合的发酵温度为28～33℃。现代酿醋工业多采用深层发酵工艺，在此过程中，初始乙醇含量和温度是发酵的关键因素。乙醇是醋酸发酵的底物，并为醋酸菌生长代谢提供能量，当乙醇含量超过40 g/L时醋酸菌的生长会受到抑制［6］。乙醇主要影响甚至改变细胞膜的组织、通透性和质子流，导致细胞生长缓慢和产酸量低［7］。另一方面，温度是影响醋酸菌生长和代谢的重要因素，是醋酸菌氧化酒精生成乙酸的必要条件。因为发酵过程是一个热积累的过程，所以随着发酵的进行，培养温度会逐渐超过醋酸菌的最适生长温度（30℃），温度过高会使醋酸发酵的基本酶变性，细胞膜损伤，导致细胞分散［8］。

在深层发酵酿醋工艺中，初始乙醇体积分数一般＞6%，这对醋酸菌的耐乙醇性能具有较大的考验；在夏季高温时，控制酿醋温度为30℃需要花费大量的冷却成本，要克服以上问题，就需要筛选同时能耐受高含量乙醇和高温的优良醋酸菌。NDOYE B等［9］从撒哈拉以南非洲的热带产品中筛选出耐受42℃高温的醋酸菌，利用该菌种进行生产极大地降低了酿醋工业中的冷却成本问题；PERUMP ULI P等［10］从斯里兰卡椰子汁醋中筛选出了一株耐40℃高温的巴氏醋杆菌，该菌种各项特性均适用于椰汁醋的酿造；孙文英等［11］用溴甲酚绿平板法从腐烂水果中成功分离纯化出了一株耐体积分数9%乙醇、38℃高温的醋酸菌，该菌种有较好的应用价值。

本研究从传统发酵工艺的醋醅中筛选出同时具有耐高乙醇、耐高温和高产酸特性的醋酸菌，利用生理生化试验和16S rDNA同源序列分析，对其进行鉴定和发酵特性研究。同时，比较该菌种与工业菌种AS1.41在深层发酵中的发酵特性。为醋酸菌的筛选提供较好的参考价值，为醋酸菌耐受性机理的研究做好铺垫工作。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1原料与试剂

发酵5～7 d的醋醅：凤阳醋厂醋醅和丹阳醋厂醋醅；醋酸菌AS1.41：中国典型微生物保藏中心；无水乙醇、氢氧化钠（NaOH）、碳酸钙、酚酞、葡萄糖、琼脂、琼脂糖等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；脱氧核糖核酸（deoxyribonuc1eic acid，DNA）提取试剂盒和胶回收试剂盒：上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.1.2培养基

耐乙醇筛选培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，MgSO40.01%，CaCO32%，琼脂2%，乙醇10%，pH自然。

富集培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，MgSO40.01%，pH自然。

液体培养基：葡萄糖2%，酵母粉2%，MgSO40.01%，乙醇4%。

碳酸钙平板培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，CaCO32%，琼脂2%。

1.2仪器与设备

SW-CJ净化工作台：苏州净化设备有限公司；I8双光束紫外可见分光光度计：济南海能仪器有限公司；DYY-7C电泳仪：北京市六一仪器厂；FY50高压蒸汽灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；D3024R台式高速冷冻微量离心机、TC-XP基因扩增仪：杭州博日科技有限公司；FR-200A型凝胶成像仪：上海实验仪器厂有限公司；SY-3010发酵罐：上海世远生物设备工程有限公司。

1.3实验方法

1.3.1菌株的富集培养

取醋醅各1g，加入100mL蒸馏水中，30℃培养3～5 d，取自然发酵液5 mL，装入含有100 mL富集培养基的三角瓶中，30℃、180 r/min培养2 d，即可得到菌株的富集培养液。

1.3.2菌株的定性试验

取含有菌体的富集培养液20 mL，以10 000 r/min的转速离心3 min，离心除去醋酸菌发酵液中的菌体，取上清液5 mL，用2.5 mo1/L的NaOH溶液中和至pH 7.0，加入质量浓度50 g/L的氯化铁溶液4～6滴摇匀，观察溶液是否变成黄褐色，再加热至沸腾，如出现红褐色沉淀则菌种确定为产醋酸菌［12］。

1.3.3耐高乙醇、耐高温醋酸菌的初步筛选

取含有醋酸菌的富集培养液1 mL，用生理盐水依次稀释到10-6，分别取200 μL 10-5和10-6的稀释液涂布于含有体积分数10%乙醇的碳酸钙平板培养基上，30℃培养72 h，挑出产生透明圈的单个菌落，即可得到耐体积分数10%乙醇的菌株。对筛选出的耐乙醇菌株进行耐高温研究。

1.3.4生理生化试验

醋酸菌的生理生化试验参照伯杰士细菌鉴定手册（第八版）。

1.3.5高耐受性菌株的鉴定

按照上海生工生物工程技术服务有限公司的SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取5株高耐受性菌株的基因组DNA，作为模板。进行聚合酶链反应（po1ymerase chain reaction，PCR）扩增的16S rDNA引物为：27 f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCAG-3′）和1492 r（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）［13］。电泳确定成功后，委托生工生物工程（上海）有限公司进行16S rDNA基因扩增序列测序。测序后得到菌种的16S rRNA序列，将得到的16S rRNA序列通过BLAST程序提交，在美国国家生物技术信息中心（nationa1 center of biotechno1ogy information，NCBI）在线数据库中进行同源序列检索。将目标菌株和通过基于局部比对算法的搜索工具（basic 1oca1 a1ignment search too1，BLAST）检索到的与之具有较高的同源性菌株的16S rDNA序列作最大同源性比较分析，同时利用MEGA 5.0软件采用相邻法（neighbor-joining，NJ）［14］构建系统发育树。

1.3.6菌株发酵性能的测定

耐高温性能测定：对筛选出的所有单菌落富集培养，取对数期菌液4 mL加入含有96 mL液体培养基的500 mL锥形瓶中，每种单菌落分别在30℃、33℃、35℃、37℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃的摇床中培养，摇床转速180 r/min，每隔24 h测量菌种的生长量OD600nm值及产酸量。

耐乙醇性能测定：分别取对数期菌液4 mL加入含有96 mL液体培养基（分别含有体积分数为2%、4%、6%、8%、10%、11%、12%、13%的乙醇）的500 mL锥形瓶中，30℃、180r/min的摇床中培养，每隔24h测量菌种的生长量OD600nm值和产酸量。

1.3.7发酵罐发酵

在10 L发酵罐中，比较菌株FY4与菌株AS1.41的发酵性能，温度设为30℃或37℃，初始乙醇浓度为4%、6%、8%、10%。搅拌速度120 r/min，溶解氧浓度维持在22%。每隔24 h测定产酸量。

1.3.8菌株生物量及产酸量的测定

菌体密度：使用分光光度计在波长600 nm处测定吸光度值，用OD600nm值表示菌体生物量。

产酸量测定：取1 mL菌株发酵液于250 mL三角瓶中，再加入50 mL蒸馏水，加入2滴0.5%的酚酞作指示剂，然后用标定的0.1 mo1/L NaOH溶液滴定至浅粉色，30 s不变色，即达到滴定终点，产酸量计算公式如下（以醋酸计）：

式中：V为发酵液样品滴定所有的NaOH溶液的体积，mL；V0为以空白培养基为对照滴定所用NaOH溶液的体积，mL；CNaOH为NaOH溶液的物质量浓度，mo1/L；V样为样品的体积，mL；60为醋酸的分子质量，g/mo1。

2　结果与分析

2.1高耐受性菌株的初步筛选

经过醋酸菌的定性试验，找出含有醋酸菌的富集培养液，将稀释后的富集培养液涂在含有体积分数10%乙醇的碳酸钙平板培养基上，30℃培养3 d，结果如图1所示。

由图1可知，有大量的单菌落产生了透明圈，这表明这些菌株在体积分数为10%的乙醇培养基中仍然能生长及产酸。透明圈越大表明菌株对乙醇的耐受能力越强。因此，挑出透明圈上的菌种进行平板划线纯化，最终共筛出14株耐体积分数10%乙醇的菌株。

图1　耐乙醇菌株筛选结果Fig.1 Screening results of ethanol-tolerant strain

对筛选出的14株耐乙醇菌株进行耐高温筛选，结果如表1所示。

表1　5株菌耐受性试验结果Table 1 Tolerance experiment results of five strains

由表1可知，共筛出5株耐体积分数10%乙醇、耐37℃高温的菌株，分别命名为菌株FY1、FY2、FY3、FY4和FY5。培养温度为30℃时，FY3和FY4可以在含有12%乙醇的培养基上正常生长，菌株FY1和FY5可在含有11%乙醇的培养基上正常生长。培养温度为37℃时，FY4在含有体积分数12%乙醇的培养基上可微弱生长，菌株FY3和FY4在含有体积分数11%乙醇的培养基上可以正常生长，菌株FY1和FY5在含有体积分数11%乙醇的培养基上几乎停止生长，菌株FY2仅可以耐受体积分数为10%的乙醇。因此，5株菌种中，菌株FY4的耐受性最强，它可以同时耐受体积分数11%的乙醇和37℃高温。

2.2生理生化试验

为了初步确定5株菌种的种属关系，根据伯杰士细菌鉴定手册（第八版）中醋酸菌的生理生化特征的描述，对5株菌种的生理生化特征进行了测试，结果如表2所示。

表2　5菌株及菌株AS1.41的生理生化特性结果Table 2 Physiological-biochemical characteristics results of five strains and strain AS1.41

由表2可知，5株菌种均为革兰氏阴性菌种，参照伯杰士细菌鉴定手册（第八版）对醋酸菌的分类，以巴氏醋杆菌AS1.41作参照菌株，由表2可以看出，5株菌种所测试的生理生化特征几乎均与巴氏醋杆菌AS1.41相同。因此，初步认定5株菌种均为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）。

2.3菌株的鉴定结果

以提取的5株菌的DNA作为模板，采用引物：27 f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCAG-3′）和1492 r（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示。

图25　株菌16S rDNA PCR扩增电泳图Fig.2 16S rDNA PCR amplification electrophoretogram of five strains

由图2可知，通过PCR扩增后，可发现产物大小约为1 500 bp。5株菌种的PCR产物经上海生工进行测序，全长为1 452 bp。NCBI对比结果表明所有筛选的菌株均与巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）序列的相似性＞99%。采用相邻法构建系统发育树，分析醋酸菌的分类位置。结果如图3所示。

图3　5菌株的系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree of five strains

由图3可知，5株筛选所得的醋酸菌均显示与巴氏醋杆菌具有最亲近的关系。5株筛选所得的醋酸菌与巴氏醋杆菌AS1.41的序列相似性＞99%（菌株FY1、FY2、FY3、FY4 和FY5与巴氏醋杆菌AS1.41的相似性分别为99.18%、99.23%、99.36%、99.32%和99.33%）。因此，菌株FY1、FY2、FY3、FY4和FY5应归属于巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）。

2.4菌株生产性能测定

2.4.1耐高温性能

考察温度对5株菌种的生长量OD600 nm和产酸量的影响，结果见图4。

图4　温度对5株菌OD600 nm（A）和产酸量（B）的影响Fig.4 Effect of temperature on OD600 nm（A）and acetic acid production（B）of five strains

由图4可知，随着温度从30℃升至43℃，菌株FY1的生长量OD600 nm值呈下降趋势，产酸量逐渐降低；当温度＜37℃，温度对菌株FY2、FY3、FY4和FY5的生长量OD600 nm值和产酸量影响较小，当温度升至40℃时，菌株FY3和FY4依然保持较高的生长及产酸性能，且在42℃时，菌株FY4依然保持较高的产酸量（33.5 g/L）；在44℃时，所有菌株几乎不生长，且无产酸量性能。结果表明，FY4对温度的耐受性最强，其最高可耐受43℃的高温。

2.4.2耐乙醇性能

考察不同体积分数的乙醇对5株菌的生长量OD600nm值和产酸量的影响，结果见图5。

由图5可知，随着乙醇体积分数的增加，菌株生长量OD600nm值呈下降趋势，菌种生长受到的抑制作用逐渐增强。当乙醇体积分数为12%时，菌株FY1和FY2停止生长，菌株FY3、FY4和FY5依然能够生长及产酸；菌株FY4的产酸量最大，在乙醇体积分数为10%时可达61.2 g/L。综合图4和图5，结果表明，FY4是耐高温和耐乙醇最强、产酸量最高的菌株，其可以耐受体积分数12%的乙醇，43℃的高温。

图5　乙醇体积分数对5株菌OD600 nm（A）和产酸量（B）的影响Fig.5 Effect of ethanol content on OD600 nm（A）and producing acid amount（B）of five strains

2.5发酵罐发酵

图6　菌株FY4与AS1.41发酵特性的比较Fig.6 Comparison of fermentation characteristics of strain FY4 and strain AS1.41

在工业发酵的过程中，初始乙醇体积分数通常低于10%，发酵的温度通常不超过37℃，因此，为了探究在复合条件下菌株FY4的发酵特性，本研究选取的温度为30℃和37℃，初始乙醇体积分数为4%、6%、8%、10%，在该条件下，对菌株FY4和菌株AS1.41在10 L发酵罐中的产酸性能进行比较，结果如图6所示。

由图6可知，菌株FY4的产酸量始终大于同一条件下菌株AS1.41的产酸量。在30℃、10%乙醇的条件下，菌株FY4的产酸量是菌株AS1.41的2.86倍，菌株FY4的产酸量达到最高为62.9 g/L；在37℃、体积分数10%的乙醇条件下，菌株FY4的产酸量虽然有所降低，但是仍然达到42.2 g/L，而菌株AS1.41几乎停止产酸。结果表明，菌株FY4可以同时耐受高乙醇和高温，并产生大量的醋酸，该菌株在工业生产上有潜在的应用价值：即可以降低初始乙醇对菌种的抑制作用，还能减少高温季节酿醋时的冷却费用。

3　结论

考虑到中国传统醋醅中蕴含着丰富的醋酸菌资源，运用高乙醇碳酸钙平板从醋醅中定向筛选耐乙醇醋酸菌，进一步研究其对温度的耐受性，初步筛选出具有耐乙醇、耐高温、高产醋特性的酸菌株。对其进行生理生化试验及16SrDNA测序分析，初步认定其为巴氏醋杆菌（Acetobac ter pasteurianus）。结果发现菌株FY4可耐受体积分数12%的乙醇、43℃高温，且在乙醇体积分数为10%，温度为30℃条件下产酸量达到最高，为61.2 g/L。将菌株FY4的发酵特性与工业菌株AS1.41进行了对比，在10 L发酵罐试验中，菌株FY4的产酸量始终高于菌株AS1.41，在37℃，体积分数10%乙醇的条件下，菌株FY4产酸量达到42.2 g/L，而工业菌株AS1.41在此条件下几乎停止产酸。这表明菌株FY4具有高的耐受性，可产生大量的醋酸，在工业生产中有潜在应用价值，对高耐受性醋酸菌的筛选具有重要的参考价值，对酿醋工艺的提升有一定的指导意义。

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Screening and fermentation characteristics of acetic acid bacteria with ethano1 and high temperature to1erance

CHEN Yang，WANG Chao，GAO Bing，LI Dongsheng，XU Ning，HU Yong* （Hubei Research Center of Food Fermentation Engineering and Techno1ogy，Hubei Co11aborative Innovation Center for Industria1
Fermentation，Co11ege of Food and Pharmacy，Hubei University of Techno1ogy，Wuhan 430068，China）

Five acetic acid-producing strains with ethano1 and high-temperature to1erance were iso1ated from industria1 fermented grains of vinegar. The five strains were identified asAcetobacter pasteurianuspre1iminari1y by physio1ogica1 and biochemica1 experiments and 16S rDNA homo1ogous sequence ana1ysis.In the to1erance experiments of the five strains，the strain FY4 cou1d resist 12%ethano1 and 43℃，and the acid production reached to the maximum of 61.2 g/L under the 30℃and a1coho1 concentration 10%.In the 10 L fermentation tank experiments，the acid production of strain FY4 was a1ways higher than that of strain AS1.41.Under the conditions of 37℃and a1coho1 concentration 10%，the acid production of strain FY4 was 42.2 g/L，and strain AS1.41 a1most stopped producing acid.The resu1t showed that strain FY4 had high to1erance and cou1d produce a 1arge amount of acetic acid.It had potentia1 app1ication va1ue in the industria1 production.

Acetobacter pasteurianus；high-temperature to1erance；ethano1 to1erance；screening；submerged fermentation

TS264.2

A

0254-5071（2015）12-0028-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.007

2015-10-28

湖北省自然科学基金（2015CFB678），湖北省级教育部门青年人才项目（Q20151412）

陈洋（1988-），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物和发酵工程。

胡勇（1980-），男，讲师，博士，研究方向为细胞工程。