电针“内关”“心俞”对急性心肌梗死大鼠心肌组织MMP-2、TIMP-2表达的影响

杜慧静，陈 峰，唐关敏，徐文博

（1.浙江中医药大学，浙江杭州310053； 2.嘉兴市第一医院心内科，浙江 嘉兴310053；3.嘉兴市第一医院中医针灸科，浙江嘉兴310053）

急性心肌梗死（AMI）是缺血性心脏病中死亡和致残的主要原因［1-2］。介入是治疗AMI最有效的方法，但受梗死面积及再灌注时间的限制并可能引起进一步的心肌损伤，缺血缺氧一旦发生，会导致心肌坏死，继发心律失常、心室重构等。目前已经证实针刺在临床上治疗心律失常为行之有效的手段［3］，且近年来的研究发现针刺对缺血性疾病有调节作用。本研究旨在通过研究针刺对基质金属蛋白酶（MMP-2）、组织基质金属蛋白酶-2（TIMP-2）的调节作用探讨电针对AMI的疗效及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级 SD 雄性大鼠 32只，体重（270±20）g，由江苏大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（苏）2013-0011。适应性饲养5 d后开始实验，随机分为正常组8只，余16只大鼠复制AMI模型，模型复制成功后随机分为模型组和电针组各8只。

1.2 仪器与试剂

小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司），LH202H型韩氏穴位神经刺激仪（北京华卫有限公司生产），生物系统信号采集仪（淮北正华生物仪器设备有限公司），正置显微镜［OLYMPUS（CX41）公司］，恒温烘箱（上海恒一科学仪器有限公司），石蜡切片机（徕克公司）。牛血清蛋白（BSA）（北京索莱宝生物科技有限公司），DAB浓缩型试剂盒（上海长岛生物技术有限公司），中性树脂（上海长岛生物技术有限公司），二抗（上海长岛生物技术有限公司），引物及探针（TAKARA公司），荧光定量PCR仪（Applied Biosystem），FTC3000HT（Funglyn Biotech Incorporated）。

1.3 造模及针刺方法

采用冠状动脉前降支结扎法复制大鼠AMI模型。4%水合氯醛1 mL/kg腹腔注射麻醉，四肢固定，经口气管盲插，连接小动物呼吸机辅助通气，呼吸频率 70 次/min，潮气量 2～3 mL，呼吸比为 1∶2。肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1.0～2.0 mm处用6/0线结扎冠状动脉前降支，结扎后可见左室前壁失去原有光泽，色变苍白，并出现搏动减弱，心电监测可见肢体导联R波振幅明显升高，ST段抬高，证实AMI模型制备成功。术后注射青霉素预防感染。电针组取大鼠双侧“内关”“心俞”，穴位参照《实验针灸学》介绍方法选取；用30号半寸毫针垂直刺入2.0～3.0 mm，连接韩氏穴位神经刺激仪，频率2 Hz/100 Hz等幅疏密波，电流强度1 mA，以肢体出现轻微抽动为度。每天1次，连续5 d。正常组和模型组不进行针刺。

1.4 观察指标及检测方法

心电图检测：将大鼠以4%水合氯醛腹腔注射麻醉固定，将针电极插入四肢皮下作为肢导联的电极，连接生物系统信号采集仪观察记录标准肢体Ⅱ导心电图，记录各组心电图。

免疫组化：免疫组化染色操作步骤按试剂盒说明书进行。在OLYMPUS光学显微镜下200倍放大拍照，每张切片在近梗死区随机观察5个视野，分析阳性表达面积。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）：取心肌组织，用Trizol法提取RNA，检测RNA纯度及浓度，取纯度好的样品进行逆转录反应，12.5 μL反应体系，cDNA置-20℃保存备用。RT-PCR反应体系为25 μL，ddH2O：10.5 μL，SYBR Premix Ex TaqTM（2×）：12.5 μL，PCR-F（10 μM）：0.5 μL，PCR-R（10 μM）：0.5 μL，模板 cDNA：1.0 μL，反应条件：95 ℃，1 min；40 个循环：95 ℃，10 s；64 ℃，25 s（收集荧光）；熔点曲线分析55℃to 95℃。每个样本进行3个重复，与正常组进行相对定量分析比较，计算mRNA的相对表达量。以RNA18S为内参照，对目标基因进行归一化处理，比较相同样品中目标基因的量。采用相对定量法，本实验结果采用2△Ct法对样本中的基因表达水平进行比较，测定各组MMP-2、TIMP-2相对于内参基因表达量。RT-PCR引物及相关情况见表1。

表1 Real-Time PCR引物及相关情况

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 心电图结果

各组心电图检查结果见图1。

图1 各组心电图检测结果

从图1中可以看出，结扎左冠状动脉前降支后，大鼠Ⅱ导联心电图上出现ST段上抬，T波抬高。电针5 d后大鼠心率基本恢复正常有轻度ST段异常。AMI组5 d后心电图T波呈现低平状态。

2.2 Cx43阳性表达面积

N组、AMI组、E组Cx43阳性表达面积分别为957.00±44.50，526.00±4.58，605.00±10.44。模型组Cx43阳性表达面积较正常组明显下降（P<0.01），电针组的Cx43阳性表达面积与模型组比较有显著上升趋势（P<0.01）。

2.3 MMP-2、TIMP-2表达量的变化

模型组MMP-2表达量较正常组稍有上升，但是差异无统计学意义，模型组TIMP-2的表达量较正常组显著下降（P<0.05）。电针组MMP-2、TIMP-2的表达量与模型组比较均明显上升（P<0.05）。结果见表2。

表2 各组MMP-2、TIMP-2表达量 （±s）

表2 各组MMP-2、TIMP-2表达量 （±s）

注：与正常组比较，1）P<0.05；与模型组比较，2）P<0.05

组别 n MMP-2 TIMP-2正常组 80.14±0.0324.35±13.09模型组 80.18±0.056.15±4.731）电针组 81.69±0.921） 16.11±4.642）

3 讨论

急性心肌梗死典型症状为胸骨后或心前区压榨样疼痛，故依据其症状特点可归属于中医的“胸痹”“真心痛”“厥心痛”。中医认为其病因与气虚、血瘀、痰凝、气滞相关。唐朝孙思邈在《千金要方》和《千金翼方》中指出“心痛暴出，绞急欲绝，灸神府百壮……”，“心痛如椎针刺，然谷、太溪主之”“心痛短气不足以息，刺手太阴”“胸痹引背时寒，间使主之”。以上论述均为针灸治疗的有效经验。

现代研究表明，心肌梗死后心律失常、心室重构发生等造成一系列损伤。有研究证实，细胞外基质（ECM）的过分降解在心室重构中发挥一定作用，其中MMP在ECM降解中起重要作用，新近研究表明MMP/TIMP之间的平衡在维持组织结构的完整和内环境稳定中起重要作用［4］。MMP-2是MMP家族中的重要成员，主要在心室合成，是一组能特异降解ECM的蛋白水解酶［5］。TIMP是MMP的组织抑制因子，参与调解组织局部MMP的活性［5］。Cx43是心肌和心室肌细胞的主要连接蛋白，也是细胞内的主要电流传导体，如果功能异常易引起心律失常和心肌冲动传导异常，其表达量与缺血性心脏病发展进程有关系［6］。

本研究采用电针疗法，在针刺腧穴的基础上，加以脉冲电的治疗作用，更能正确地掌握刺激参数，以期对AMI有更好的疗效。本实验结果发现结扎大鼠左冠状动脉前降支后，大鼠Ⅱ导联心电图上出现ST段上抬，T波抬高，而连续电针5 d后急性心肌梗死大鼠心电图得到改善，ST段下移，心律恢复。模型组梗死心肌周围Cx43表达下降，但是针刺组Cx43有明显升高，说明针刺可以保护心肌组织的损伤，调节心律。电针组MMP-2表达升高，TIMP-2表达下降，说明电针可以通过调节MMP-2、TIMP-2的表达保护缺血梗死心肌组织，且有效对抗心律失常。

综上所述，电针内关、心俞穴可以调节心肌组织微环境相关基因的表达，调节心律失常，保护缺血梗死心肌组织，防止心室重构。

［1］World Health Organization.Guidelines for the treatment of malaria［M］.2ndEdition.Geneva：World Health Organization，2006.

［2］Sadowski M，Janion-Sadowska A，Gasior M，et al.Higher mortality in women after ST-segment elevation myocardial infarction in very young patients［J］.Arch Med Sci，2013，9（3）：427-433.

［3］钟辉，李国彰.针刺治疗心律失常的研究进展［J］.中国医药学报，2002，17（增刊）：42-46

［4］Ahmed S H，Clark L L，Pennington W R，et al.Matrix metalloproteinases/tissue inhibitors of metalloproteinases：relationship between changes in proteolytic determinants of matrix composition and structural，functional，and clinical manifestations of hypertensive heart disease［J］.Digest of World Core Medical Journals（Cardiology），2006，113（17）：2089-2096.

［5］Biolo A，Fisch M，Balog J，et al.Episodes of acute heart failure syndrome are associated with increased levels of troponin and extracellular matrix markers［J］.Circ Heart Fail，2010，3（1）：44-50.

［6］Lerner D L，Yamada K A，Schuessler R B，et al.Accelerated onset and increased incidence of ventricular arrhythmias induced by ischemia in Cx43-deficient mice［J］.Circulation，2000，101（5）：547-552.