指纹图谱在中药柴胡质量评价中的应用研究

2015-08-15王斌张腾霄宋相周唐志国杨国亮曹玉铭

绥化学院学报 2015年2期

王斌张腾霄宋相周唐志国杨国亮曹玉铭

（1.绥化学院食品与制药工程学院；2.绥化市食品药品检验检测中心黑龙江绥化 152061）

《中国药典》2010版收载的柴胡为伞形科多年生草本植物柴胡（北柴胡）BupleurumchineseDC.和狭叶柴胡（南柴胡）BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根,近代药理研究表明柴胡具有镇静、镇咳、抗炎、保肝利胆等药理活性[1]。由于中药成分复杂，单一成分作为质量控制指标已不能适应中药质量控制的要求。而中药指纹图谱可反映中药的整体化学特征及其多组分、多作用靶点的特点。对中药“安全、有效和质量可控，保证物种的延续，遗传基因的稳定性，品种的地道性和药用价值”起着至关重要的作用。本文通过文献检索的方式，对近年来指纹图谱在中药柴胡质量评价中的应用进行综述，为柴胡的进一步研究和临床应用提供理论依据。

一、中药指纹图谱

中药指纹图谱技术指某种（或某产地）中药材或经适当的处理后，采用一定的分析手段得到的能够标志该中药材或中成药特征的谱图。中药指纹图谱能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。中药指纹图谱主要分为化学指纹图谱（包括色谱指纹图谱、光谱指纹图谱）和DNA指纹图谱。

二、指纹图谱在柴胡质量评价中的应用

（一）色谱技术指纹图谱。色谱技术是中药化学成分分离分析及质量评价和控制的核心技术，其中薄层色谱（TLC）应用最早，目前高效液相色谱（HPLC）技术逐渐成为中药质量评价的主要技术，其他还有气相色谱法（GC）和高效毛细管电泳（HPCE）等。

1.TLC法。李腾等[2]利用TLC指纹图谱技术，揭示柴胡及其制剂前后皂苷类成分的变化，展开剂为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶4∶2∶1)，显色剂为1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液-磷酸(3∶1)，检视条件为365nm。经TLC法对比柴胡经煎煮制成制剂前后，发现柴胡皂苷d可转化成柴胡皂苷b2，柴胡皂苷a与柴胡皂苷c基本没有变化，有助于揭示中药柴胡发挥功效的物质基础。

2.HPLC法。高效液相指纹图谱，即色谱技术对中药所含化合物进行分离和检测，得到表征各类成分的系列色谱峰，通过色谱峰的数目、峰位和峰高度的特异性构建特定化学指纹图谱，该指纹图谱反映出研究对象的精细化学构成特征，可用于中药的鉴定和质量评价。

（1）皂苷类成分。李腾等[2]利用HPLC指纹图谱技术，揭示柴胡及其制剂前后皂苷类成分的变化。采用Waters XBridgeRP18色谱柱，乙腈-水为流动相，检测波长208、252nm。经HPLC指纹图谱对比研究，进一步证明了柴胡皂苷d向柴胡皂苷b2转化。余菁等[3]建立HPLC方法测定柴胡皂苷a、d含量。色谱柱为YMC-PackODS-AC18，乙腈-水(43∶57)为流动相，检测波长为203nm。白雪梅等[4]建立同时测定柴胡中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的高效液相色谱法。色谱柱为HypersilBDSC18，检测波长:210nm，流动相为乙腈∶水=50∶50。刘晓节等[5]采用HPLC柱前酸化法测定北柴胡引种前后和不同品种药材中柴胡皂苷a、d的含量。黄春燕等[6]采用HPLC测定不同产地北柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量，以kromasilC18为色谱柱；流动相为乙腈-水，检验波长204nm。李棣华等[7]建立HPLC指纹图谱分析方法，测定了10个不同来源山西产柴胡样品。林东昊等[8]建立RP-HPLC法，分离和测定中国23种61个产地的柴胡属植物样品中柴胡皂苷a、c、d的含量。采用C18色谱柱，以乙腈-水为流动相，检测波长210nm。

张宏娜等[9]建立高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法同时测定柴胡中柴胡皂苷a、c、d、f含量。采用PhenomenexC18色谱柱，以乙腈-水为流动相。茅仁刚等[10]所建立的RP-HPLC法适合不同品种柴胡中柴胡皂苷a、c、d的定量分析。李媛媛等[11]利用柱前衍生化HPLC-UV测定柴胡皂苷a、d的含量。评价不同产地、不同品种柴胡样品的质量优劣。聂飒等[12]利用HPLC法建立了净柴胡和醋柴胡的指纹图谱，并初步研究了二者之间差别。赵丽等[13]研究柴胡总苷的高效液相色谱指纹图谱，测定柴胡总苷中柴胡苷a、d的含量。利用HPLC-DAD法测定了10批柴胡总皂苷样品。宋宏刚等[14-16]采用高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)法建立柴胡中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的含量测定方法。李艳荣等[17]建立同时测定柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量及其HPLC指纹图谱。采用Zorbax SB-C18色谱柱，乙腈溶液系统梯度洗脱，检测波长210nm。15批药材的HPLC指纹图谱共确立6个共有峰。李竞等[18]采用HPLC法，以C18色谱柱、乙腈-水为流动相，检测波长为210nm，测定样品中柴胡皂苷a、d的含量。

（2）黄酮类成分。袁王俊等[19]定量测定不同部位和不同产地柴胡中4种黄酮（芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素）。以ODS2色谱柱、乙腈-0.12%磷酸水为流动相进行梯度洗脱，检测波长为360nm。为柴胡茎、叶进行进一步的研究和开发提供了理论基础。韦英杰等[20]建立HPLC法同时测定柴胡和春柴胡中柴胡皂苷a、d；4个黄酮类活性成分芦丁、槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量。采用AgilentZorbaxC18色谱柱，以0.1%磷酸水-乙腈为流动相。

3.GC法。气相色谱是封闭性色谱，受外界影响较少，具有高性能、高选择性、高灵敏度等优点。适合于药材及制剂中挥发性成分且热稳定性药材的鉴定。郭雪清等[21]应用GC法建立柴荆注射液中柴胡挥发油的指纹图谱，为柴荆注射液的质量控制提供依据。孙玲等[22]运用毛细管气相色谱法建立柴胡挥发油的指纹图谱。从6批道地药材产区的柴胡挥发油GC指纹图谱中确定16个共有峰，并进行不同产区柴胡相似度的比较，相似度大于0.9。李秀琴等[23]建立评价柴胡挥发油质量优劣的指纹图谱分析方法。采用毛细管气相色谱分析，以正壬烷为内参照物，测定了25批不同产地柴胡药材的GC指纹图谱。

4.GC-MS法。GC-MS鉴定技术是目前分析和鉴别具有挥发性、半挥发性成分中药的首选技术。廖远熹等[24]运用静态顶空毛细管气相色谱-质谱联用技术快速鉴别市售柴胡是否经硫黄熏制。孙宗喜等[25]通过GC-MS联用技术对柴胡根和茎中的挥发油成分进行分析和鉴定，用色谱峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量。马璇等[26]采用GC-MS技术，从提取的北柴胡地上部分挥发油中鉴定出25个化合物，地下部分鉴定出14个化合物。

（二）光谱技术指纹图谱。

1.紫外光谱法（UV）。根据不同药材紫外吸收光谱互异这一特性进行鉴别。如紫外吸收峰位置和数目的差异。李竞等[18]采用紫外分光光度法，以柴胡皂苷d为对照品，在波长545nm处对样品中的总皂苷进行含量测定。许腊英等[27]用紫外谱线组法鉴别柴胡和醋柴胡，比较炮制前后的变化。

2.原子吸收光谱。刘伟等[28]考察栽培柴胡药材的重金属含量情况。以原子吸收光谱法测定样品中的铅、镉、砷、汞和铜的含量。该法快速、可靠，为柴胡重金属元素的测定提供了一种简便方法。

（三）分子技术指纹图谱。

1.DNA条形码指纹图谱技术。DNA条形码是指利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段作为物种标记而建立的一种新的生物鉴定方法。该方法通过筛选确定通用条形码，建立条形码数据库和鉴定平台，通过生物信息学分析方法分析比对DNA数据，进而对物种进行鉴定。迟莹等[29]采用改良的CTAB法提取柴胡及常见伪品的干根基因组DNA，设计鉴别正品柴胡及其伪品的特异性引物，利用PCR扩增技术对正品柴胡及其伪品进行DNA指纹鉴定。

2.随机扩增多态性DNA（RAPD）指纹图谱。根据PCR技术，采用人工合成的随机引物，以植物组织分离的基因组DNA为模板，进行多态性DNA片段的随机合成反应，从而根据DNA片段，将植物不同基因组予以区别。

南晓洁等[30]比较研究了用不同方法提取柴胡样品基因组DNA，探索了一种适用于柴胡药材干根DNA提取的方法，为实现以分子标记方法辨别柴胡药材奠定基础。

3.生物芯片技术（Bio-chip）。将大量探针分子（DNA，RNA）固定在支持物上后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，对样品分子进行定性、定量和结构分析。

4.简单重复序列间标记技术(ISSR)。ISSR标记是适于种间或种内变异调查的一种分子标记方法，其结果可用来建立中药的指纹图谱。隋春等[31]建立了柴胡ISSR-PCR反应体系，筛选出30条引物并确定了最佳退火温度，为应用ISSR技术鉴定柴胡种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。