UPLC-QTof-MS 测定不同提取条件下柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的转化规律

郭 智，彭 冰，李宗阳，潘瑞乐*

1中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193;2 首都医科大学附属北京中医医院 北京 100010

柴胡为临床的常用中药，其原植物为伞形科柴胡属植物北柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Wild 的干燥根，具有疏散退热、疏肝解郁、升阳举陷之功效［1］。研究表明柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 是柴胡药材中含量高、活性好的两个主要成分，《中国药典》(2010 版)记载柴胡药材质量标准以柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 作为定性定量的控制指标。文献［2-4］指出柴胡皂苷a、d 结构含有醚键，遇酸或受热不稳定，因此测定柴胡皂苷a、d 含量时建议采用低温提取并加入少量碱水。本课题组前期在测定某柴胡制剂中柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的含量时，发现制剂中柴胡皂苷d 未能检出，柴胡皂苷a 的含量下降了很多。相同药材采用甲醇低温提取时柴胡皂苷a、d 具有较高的含量;但采用水煮提取时，发现水提液呈酸性，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 均发生了不同程度的变化。柴胡作为临床常用中药，汤剂及中成药制剂中使用很多，且大多以水煎煮法提取。以水作溶剂加热提取柴胡药材时，柴胡皂苷a、d 如何变化、变化成何种化合物及变化程度未见有文献报道。本研究利用高灵敏度的UPLCQTof-MS 对不同提取条件柴胡药材柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的变化进行定性研究，以期找到柴胡药材和制剂质量控制的合理指标。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Acquity UPLC I-class 超高效液相系统(沃特世)，Xervo G2 QTof 质谱系统(沃特世)，Acquity 工作站(沃特世)，Masslynx4.1 工作站(沃特世);Integral 3 Milli-Q 超纯水系统(默克密理博);MS105 DU电子分析天平(梅特勒);N1100 旋转蒸发仪(东京理化);KQ-250B 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。Optima LC/MS 乙腈(赛默飞)，HPLC 甲醇(赛默飞)。提取用乙醇为分析纯(北京化工厂)，提取用水为市售Wahaha 纯净水。

柴胡皂苷a(SSa)、柴胡皂苷d(SSd)标准品由中国药品生物制品鉴定所提供，批号分别为110777-200406、110778- 200506;柴胡皂苷b1(SSb1)标准品由成都曼斯特生物科技有限公司提供，批号为MUST-13 091109;柴胡皂苷b2(SSb2)标准品由天津马克生物技术有限公司提供，批号为2012-1205。柴胡样品采自甘肃陇西县，经张本刚教授鉴定为植物银州柴胡B.yinchowense 的干燥根。样品标本存于中国医学科学院药用植物研究所标本馆。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱:Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm);保护柱:VanGuand BEH C18(2.1 mm×5 mm，1.7 μm)，流动相:A 为乙腈，B 为0.01%甲酸水溶液，梯度洗脱程序:0～2 min，10%～30% A;2～9 min，30%～38% A;9～11 min，38%～50% A;11～12 min，50%～100% A;12～13.5 min，100%A;13.5～13.51 min，100%～10% A;13.51～15 min，10% A;流速:0.45 mL/min;进样量:1 μL;柱温35 ℃。

1.2.2 质谱条件

负离子，MSe模式;检测范围100～1500 Da;毛细管电压:3 kV，锥孔电压:45 V，裂解电压:45～55 V;锥孔气流量:50 L/h;脱溶剂气流量:800 L/h;源温:100 ℃;脱溶剂气温度350 ℃;准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽(Leucine-Enkephalin，m/z=554.2615)溶液做为质量锁定溶液。

在以上条件下，四种柴胡皂苷均能达到基线分离，质谱信号响应良好。

1.3 对照品溶液制备

分别精密称定柴胡皂苷a、d、b1、b2分别为2.38、2.52、1.93、2.43 mg，使用色谱甲醇定容于2 mL 容量瓶得到对照品储备液。精确吸取储备液100 μL 于25 mL 容量瓶，色谱甲醇定容后吸取2.0 mL，使用0.22 μm 微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，分别得SSa、SSd、SSb1、SSb2对照品工作液。

1.4 供试品溶液制备

1.4.1 提取方法设计

选择温度(30 ℃和100 ℃)、溶剂(水和乙醇)、酸碱度(酸性、中性和碱性)作为考查因素，设计不同的提取方法，见表1。

表1 柴胡提取方法设计Table 1 Different extraction conditions of saikosaponin a and saikosaponin d

1.4.2 制备流程

精密称定柴胡药材粉末(40 目)1.00 g，置于50 mL 梨形瓶中，精确加入25 mL 提取液，分别按照表2 设计的方法提取。各提取液过滤，滤渣用少量相同提取液润洗两次，合并滤液，减压回收至干，残渣加入色谱纯甲醇使其充分溶解，定溶于25 mL 容量瓶，摇匀。分析前用0.22 μm 微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，既得供试品溶液，编号按表1 顺序为1～12。

2 实验结果

2.1 对照品SSa、SSd、SSb1、SSb2质谱裂解规律

SSa、SSd、SSb1、SSb2属于同分异构体，在此分析条件下，SSa、SSd、SSb1、SSb2的色谱保留时间分别为6.56、10.37、8.26、6.84 min 对照品的总离子流色谱图见图1;ESI 离子源负离子模式下，它们具有基本相同的一级质谱，基峰为［M-H +HCOOH］ˉ(m/z=825.4635);二级质谱主要的碎片峰有:［M-H］ˉ(m/z=779.4594)，［M-H-Glc］ˉ(m/z=617.4050)，［MH-Glc-Fuc-］ˉ(m/z=471.3469)，SSb1和SSb2还有［M-H-Glc-Fuc-CH2OH］ˉ(m/z=423.2360)。

图1 对照品SSa、SSd、SSb1、SSb2的结构式和总离子流色谱图Fig.1 Chemical structures and total ion chromatograms of SSa，SSd，SSb1，SSb2standards

2.2 柴胡不同提取方法柴胡皂苷a 和d 的UPLCQTof-MS 研究

不同提取方法柴胡样品1～12 的UPLC-QTof-MS 色谱图见图2。

图2 中样品1～4 为酸性条件下提取的柴胡样品的UPLC-MS 色谱图。由图可知，四个样品均未检测出柴胡皂苷a(保留时间为6.56 min)、d(保留时间为10.37 min)。在常温酸性条件下提取的样品1和2 中检测到柴胡皂苷b1(保留时间为8.26 min)和柴胡皂苷b2(保留时间为6.84 min)。以水为溶剂，加酸加热回流条件提取的样品3 中，柴胡皂苷a、d、b1、b2均未检测出，在此条件下柴胡皂苷发生酸水解;以乙醇作溶剂，加酸加热回流提取的样品4中，可检测到脱去两分子糖的苷元加甲酸峰(m/z:517.3536)。

图2 中样品5～8 为中性条件下提取的柴胡样品的UPLC-MS 色谱图。由图可知，四个样品中均有柴胡皂苷a、d 检出。其中水、醇常温提取和醇加热提取的样品5、6、8 检测到柴胡皂苷a、d 为大量成分，基本无柴胡皂苷b1检出，有少量柴胡皂苷b2检出。由样品6 中小量柴胡皂苷b2的检出推测柴胡生药中也含有少量柴胡皂苷b2。水加热提取的样品7 中柴胡除有柴胡皂苷a、d 检出外，还有较大量的柴胡皂苷b2检出，测定其提取液的pH 值由中性转变为酸性(pH=4)，由于酸性条件部分柴胡皂苷d 水解开环生成柴胡皂苷b2。

图2 中样品9～12 为碱性条件下提取的柴胡样品的UPLC-MS 色谱图。由图可知，四个样品中柴胡皂苷a、d 均为大量成分，无柴胡皂苷b1检出，四个样品均有小量柴胡皂苷b2检出。加入碱可以抑制柴胡皂苷a、d 的水解开环。

对1～12 号样品色谱图进行积分，以SSa、SSd、SSb1、SSb2的最大峰面积为基峰(100%)分别计算相对含量，图3 为1～12 号样品柴胡皂苷a、b1相对含量。

图2 样品1～12 以核质比825.46 ±0.1Da 提取离子流色谱图Fig.2 Extracted ion chromatograms (825.46 ±0.1Da)of sample1-12

图4 为1-12 号样品柴胡皂苷d、b2相对含量。

图3 样品1-12 号柴胡皂苷a、b1相对含量Fig.3 Relative contents of saikosaponin a，b1of sample 1-12

图4 样品1～12 号柴胡皂苷d、b2相对含量Fig.4 Relative contents of saikosaponin d，b2of sample 1-12

3 讨论

柴胡皂苷紫外吸收很弱或无紫外吸收，传统对柴胡皂苷的测定选择紫外检测器，使用210 nm 作为检测波长［5，6］，但存在吸收较弱和干扰较多的问题。本研究选择飞行时间质谱(Q-Tof)作为检测器，解决了以上问题。同时可以给出碎片精确的分子量，有助于对化合物结构变化的跟踪和解析。前期实验通过比较正离子、负离子两种模式，发现负离子模式色谱峰型优于正离子模式，杂峰较少，故选择负离子模式。而超高效液相系统相比传统的高效液相系统能显著的缩短分析时间，提高分析效率。

本研究表明在酸性条件提取时，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 全部转化。常温时柴胡皂苷a 转化为柴胡皂苷b1，柴胡皂苷d 转化为b2;加热时柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 发生糖苷键酸水解。在中性常温条件提取时，柴胡皂苷a、d 比较稳定，但以水作溶剂加热时，柴胡皂苷d 转化为柴胡皂苷b2。在弱碱性条件下，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 均比较稳定，但四个样品仍有极小量的柴胡皂苷b2检出，但未有柴胡皂苷b1，说明柴胡皂苷b2可能是柴胡中天然存在的。

由于水作溶剂加热提取柴胡时，柴胡皂苷a、d 不稳定，并且随着加热时间的延长，柴胡皂苷a、d 会逐渐水解开环生成柴胡皂苷b1、b2。柴胡制剂多数以水加热提取，因此，柴胡制剂质量控制的指标若仍以柴胡皂苷a、d 作为指标是不科学的。柴胡制剂的质量控制建议综合考虑柴胡皂苷a、d、b1、b2总量来控制。

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