脱髓鞘疾病患者神经束蛋白155抗体的表达及临床意义

季秋虹 胡旻婧 王玉琴 柯开富

慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病（chronic inflammatory demyelinating polyradicul－oneuropathy，CIDP）、吉兰－巴雷综合征（Guillain－Barrésyndrome，GBS）、多发性硬化（multiple sclerosis，MS）及视神经脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）都是以脱髓鞘为特征的疾病，与自身免疫应答密切相关。神经束蛋白（neurofascin，NF）是神经细胞黏附分子L1家族的成员，在维持郎飞结的结构和功能中发挥重要作用［1］。Lonigro等［2］在实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis，EAN）动物模型中检测到NF的自身抗体，但目前对NF的特异性抗体在周围及中枢神经系统脱髓鞘疾病中的表达仍缺乏系统的临床分析和研究。本研究拟通过ELISA法检测脱髓鞘疾病患者血清及脑脊液中NF155的抗体水平，探讨其在脱髓鞘疾病患者中的表达及临床意义。

1 对象和方法

1.1 观察对象 选取2010－01－2014－10南通大学附属医院神经内科住院的脱髓鞘性疾病患者116例，其中包括：CIDP组23例，男13例、女10例，年龄19～75岁，平均（45.6±13.9）岁，符合INCAT诊断标准；GBS组63例，男38例、女25例，年龄17～69岁，平均（43.6±12.6）岁，符合Asbury诊断标准。其他脱髓鞘疾病（OD）组30例，男13例、女17例，年龄20～65岁，平均（42.8±13.2）岁，其中包括MS 24例（按 McDonald标准确诊），NMO 6例（均符合2006年Wingerchuk修订的诊断标准）。神经系统变性疾病（neurodegenerative diseases，ND）组33例，男16例、女17例，年龄30～71岁，平均（46.6±16.3）岁，其中帕金森病（Parkinson disease，PD）8例，符合英国脑库帕金森病诊断标准，运动神经元疾病（motor neuron disease，MND）15例，遗传性共济失调10例。对照组分为两部分，血液标本取自同一时期作者医院体检中心的健康志愿者36名，男20名、女16名，年龄23～66岁，平均（41.9±13.8）岁；脑脊液标本取自6例阑尾炎外科手术腰椎局麻患者及6例血管性头痛患者，其中男7例、女5例，年龄26～71岁，平均（43.8±15.8）岁，12例患者均排除脱髓鞘疾病可能。五组间性别、年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血清及脑脊液样本采集：各组患者均于入院次日空腹采静脉血，GBS患者起病2周后行腰椎穿刺，其他组患者入院3d内行腰椎穿刺，脑脊液送常规检查及蛋白质、糖和氯化物，MS及NMO患者查脑脊液IgG寡克隆带。对照组健康志愿者于体检中心空腹采血，对照组脑脊液取自阑尾炎外科手术腰麻患者及血管性头痛患者。各组留取血清及脑脊液标本于－80℃冻存，用于ELLSA检测。

1.2.2 ELISA 法检测 NF155抗体：采用5μg／mL的 NF－155（R＆D）包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃孵育过夜，随后用1%（质量浓度）BSA每孔200μL 37℃封闭1h。在包被好的酶标板中加入不同浓度的标准品，1∶200稀释的血清，脑脊液原液和作为空白对照的1%（质量浓度）HSAPBS，每孔100μL，37℃孵育1.5h。PBS洗3次后加 HRP标记的抗人IgG抗体100μL／孔，37℃孵育1h，PBS洗3次后每孔加入100μL显色剂，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15min后每孔加50μL终止剂，振荡混匀后以酶标仪检测450nm的吸光度值，并根据标准品建立的浓度曲线，分别计算各组样本中NF155抗体的浓度。

1.2.3 神经电生理检测：CIDP和GBS患者应用丹麦Medtronic型肌电图仪进行检查，体表电极刺激并记录正中神经、尺神经、胫神经、腓总神经运动传导速度、复合肌肉动作电位和末端运动潜伏期，顺向传导法记录正中神经、尺神经、胫神经、腓肠神经的感觉传导速度、感觉神经动作电位、F波潜伏期和出现率。

1.2.4 腓肠神经活检：对怀疑CIDP但电生理检查结果与临床表现不符的3例患者，在签署知情同意书后行左腓肠神经活检：均于局麻下于外踝后方取腓肠神经约1.0cm。（1）神经组织三色染色：冷冻切片20张，片厚10μm，亮绿－变色酸2R－磷钨酸对切片染色，每张观察5个视野。（2）透射电镜观察：4%戊二醛固定，1%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，超薄切片（70nm）10余张，醋酸铀染，枸橼酸铅复染，JEM－1230透射电镜观察髓鞘和轴索超微结构并拍照。（3）免疫荧光染色：冷冻切片2张，片厚10μm，一抗为兔抗人S－100多克隆抗体和小鼠抗人神经丝蛋白（neurofilament，NF），二抗分别为山羊抗兔IgGTRITC和山羊抗小鼠IgG－FITC，一抗、二抗均由Sigma公司孵育。400倍荧光显微镜下观察神经组织病理学改变情况并拍照观察。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析one－way ANOVA，两两比较采用SNK法。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑脊液检查 CIDP组细胞数0～10个，蛋白质0.75～2.32g／L，91%（21／23）有细胞－蛋白分离现象。GBS组细胞数0～40个，蛋白质0.5～2.0g／L，93%（59／63）有细胞－蛋白分离现象。OD组细胞数0～26个，蛋白质0.65～1.32g／L，96%（29／30）CSF－IgG 寡克隆带阳性。ND组细胞数0～10个，蛋白在正常范围内。对照组结果正常。

2.2 电生理检查 23例CIDP和63例GBS患者均行神经电生理检测，结果均显示有周围神经脱髓鞘性损害和／或轴索损害。23例CIDP患者共测定运动神经138条，感觉神经106条。运动神经传导速度（MCV）减慢66条，复合肌肉动作电位（CMAP）波幅降低35条，末端运动潜伏期（DML）延长38条。感觉神经传导速度（SCV）减慢36条，未引出15条，感觉神经动作电位（SNAP）波幅降低25条，3例出现传导阻滞，23例均有F波潜伏期延长或消失。63例GBS患者共测定运动神经358条，异常295条，感觉神经186条，SCV减慢83条，伴波幅减慢65条，62例有F波潜伏期延长或消失。

2.3 CIDP患者腓肠神经病理表现 神经组织三色染色显示：髓鞘轴索均肿胀，胶原纤维明显增生（图1A），施兰切迹密度大，结缔组织增生，提示慢性炎性反应（图1B）；电镜下可见部分有髓纤维髓鞘退变，板层结构松散，成剥离的洋葱皮样结构（图1C），髓鞘的板层状结构扭曲变形，板层结构松解，破裂、轴索破坏（图1D）；NF染色显示轴突断断续续，表达不完整（图1E）。免疫荧光染色显示雪旺细胞S－100阳性区域变薄（图1F）。

图1 CIDP患者腓肠肌神经病理表现：三色染色（bar＝10 μm）显示髓鞘轴索均肿胀，胶原纤维明显增生（A），施兰切迹密度大，结缔组织增生（B）；电镜（bar＝2μm）下可见部分有髓纤维髓鞘退变，板层结构松散，成剥离的洋葱皮样结构（C），电镜下可见髓鞘的板层状结构扭曲变形，板层结构松解，破裂、崩解、轴索裸露（D）；NF染色（bar＝10μm）可见轴突断断续续，表达不完整（E）；免疫荧光染色（bar＝10μm）显示S－100蛋白阳性区域变薄（F）

2.4 NF155抗体测定 具体结果见表1。各组血清及脑脊液NF155抗体水平差异有统计学意义（均P＜0.05）。CIDP、GBS和OD组血清及脑脊液中NF155抗体水平均较ND组及对照组增高（P＜0.01），但CIDP、GBS和OD组三个脱髓鞘疾病组间两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05），ND组与对照组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 抗NF155抗体在各组脱髓鞘疾病患者及对照组血清和脑脊液中的表达 （）

表1 抗NF155抗体在各组脱髓鞘疾病患者及对照组血清和脑脊液中的表达 （）

注：CIDP：慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病，GBS：吉兰－巴雷综合征，OD：其他脱髓鞘疾病，ND：神经系统变性疾病；a：对照组中血液标本对照36例，脑脊液标本对照12例；与对照组及ND组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

血清 脑脊液CIDP组 23 0.69±0.4＊＊ 0.45±0.18组别 n＊GBS组 63 0.62±0.42＊＊ 0.46±0.22＊＊OD组 30 0.50±0.33＊ 0.43±0.22＊ND组 33 0.34±0.14 0.27±0.18对照组 36／12a 0.35±0.17 0.27±0.16 F值0.001 0.006 8.12 3.82 P值 ＜

3 讨论

免疫介导的脱髓鞘性疾病的发病机制迄今尚不清楚。由于缺乏明确的诊断标准和可靠的血清学试验作为脱髓鞘疾病特异性诊断指标，其发病率有可能被低估。无论选择目前的哪种标准进行临床诊断，仍有部分患者因漏诊而不能得到及时、有效的治疗。已有的有研究提示，针对郎飞结的自身抗体可能是致病的重要原因。在一些自身免疫性神经系统疾病中，朗飞结区、结侧区、近结侧区的分子都有可能成为自身抗体的靶抗原［3］。

NF属于免疫球蛋白超家族，有NF155和NF186两种亚型。NF155位于郎飞结侧区胶质环中，使接触蛋白相关蛋白（Caspr）和接触蛋白（contactin）在结侧区聚集，形成间隔样连接，促进神经细胞黏附和轴突生长［4］。NF186位于郎飞结和轴突起始段，抑制细胞黏附和轴突增生。两者在神经发育及维持胶质细胞和轴索结构稳定的过程中发挥重要作用［5］。

本研究采用ELISA法检测了CIDP、GBS、MS和NMO患者血清及脑脊液中NF155抗体水平，并与神经系统变性疾病患者及健康对照者进行比较，结果显示脱髓鞘疾病患者血清和脑脊液中NF155抗体水平均较神经系统变性疾病患者及对照者明显增加（P＜0.01），这与 Yan等［6］和Mathey等［7］的研究结果一致。此前的研究发现NF的单克隆抗体可以导致实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的轴索损害［7］，海马脑片的体外培养模型也证实NF抗体以补体依赖性方式抑制轴突传导［5］，因此，NF可能是自身抗体介导轴索损害的靶抗原。抗NF155的抗体通过阻止结侧区胶质环的核心结构Caspr／contactin／NF155复合物形成，进而抑制髓鞘形成［8］。Yan等［6］的研究证实 GBS和CIDP患者血清NF155抗体水平增高，并通过动物模型验证NF155抗体结合在郎飞结，促进补体沉积，导致电压门控钠通道和郎飞结的结构被破坏。对血清NF155抗体的研究，不仅有助于增进对脱髓鞘疾病的发病机制的认识，也可能为脱髓鞘疾病的临床诊断和治疗提供了新的思路和途径。

综上所述，本研究结果显示，脱髓鞘疾病患者血清及脑脊液中存在着高水平的NF155抗体，且各脱髓鞘疾病组间血清及脑脊液中NF155抗体的水平差异无统计学意义，结合已有的报道，提示NF可能是一种普遍存在于自身免疫性脱髓鞘疾病的靶抗原，可能参与了与中枢和周围神经脱髓鞘疾病的病理生理过程。但由于本研究为小样本探讨，能否将NF155抗体作为脱髓鞘疾病诊断的血清学标志物，尚需进一步扩大临床样例深入地进行研究。

［1］Chang BJ，Cho IJ，Brophy PJ.A study on the immunocytochemical localization of neurofascin in rat sciatic nerve［J］.J Vet Med Scl，2000，1（2）：67－71.

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［3］Pollard JD，Armati PJ.CIDP－the relevance of recent advances in Schwann cell／axonal neurobiology［J］.J Peripher Nerv Syst，2011，16（1）：15－23.

［4］Sherman DL，Tait S，Melrose S，et al.Neurofascins are required to establish axonal domains for saltatory conduction［J］.Neuron，2005，48（5）：737－742.

［5］Koticha D，Babiarz J，Kane－Goldsmith N，et al.Cell adhesion and neurite outgrowth are promoted by neurofascin NF155and inhibited by NF186［J］.Mol Cell Neuro Sci，2005，30（1）：137－148.

［6］Yan W，Nguyen T，Yuki N，et al.Antibodies to neurofascin exacerbate adoptive transfer experimental autoimmune neuritis［J］.J Neuroimmunol，2014，277（1－2）：13－17.

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［8］Ng JK，Malotka J，Kawakami N，et al.Neurofascin as a target for autoantibodies in peripheral neuropathies［J］.Neurology，2012，79（23）：2241－2248.