构建M23－AQP4稳定表达的HEK293细胞应用于血清抗AQP4抗体检测的研究

吴晓牧 符青青 刘诗英 项正兵 熊英琼 张昆南

视神经脊髓炎（NMO）是主要累及视神经和脊髓的严重自身免疫性脱髓鞘性疾病。2004年Lennon等［1］首次在NMO患者血清中发现NMOIgG抗体，即抗AQP4抗体［2］，从而为认识NMO为有别于MS的独立性疾病提供了依据。目前已将血清抗AQP4抗体作为支持条件纳入NMO诊断标准［3］。血清抗AQP4抗体的检测方法主要有鼠脑间接免疫荧光法（IIF）和细胞间接免疫荧光法（CBA），以CBA 敏感性较高［4－5］，尤其以表达 M23－AQP4亚型的细胞作为底物的CBA，其抗AQP4抗体检出率可高达97%［6］。由于CBA技术要求高且耗时，难以推广使用。本文拟构建 M23－AQP4稳定的HEK293细胞（HEK293－M23－AQP4）用于血清抗AQP4抗体的检测，并探讨本研究方法检测血清抗AQP4抗体对NMO的诊断敏感性和临床实用性。

1.1 观察对象 收集2012－04－2014－04作者医院神经内科住院治疗的52例脱髓鞘性疾病患者，其中NMO符合 Wingerchuck诊断标准［3］，MS符合McDonald诊断标准，其他脱髓鞘疾病均为结合临床表现、影像、脑脊液、肌电图等检查确诊病例。其中NMO 6例、多发性硬化（MS）16例、其他脱髓鞘疾病患者30例〔包括视神经炎6例、脊髓炎14例、吉兰－巴雷综合征9例、急性播散性脑脊髓炎1例〕。以同期神经内科住院的10例非脱髓鞘性疾病患者（脑梗死3例、脑出血3例、重症肌无力2例，中枢神经系统感染2例）为对照。标本采集均征得患者同意。

1.2 主要试剂 HEK293细胞（中科院上海细胞库），pEGFP－N1－M23－AQP4质粒及pEGFP－N1质粒30%甘油菌（Invitrogen公司），无内毒素质粒提取 试 剂 〔Endo－free Plasmid Mini Kit Ⅱ （50），OMEGA公司〕，磷酸钙转染试剂、正常山羊血清工作液（碧云天生物技术公司），DMEM高糖培养基（Hyclone公司），胎牛血清、胰酶（Transgen公司），G418、7～15万单位多聚赖氨酸、4%（质量分数）多聚甲醛（Solarbio公司），兔源抗人AQP4多克隆抗体、Cy3标记的羊抗人二抗（Abcam公司），TRITC标记的羊抗兔二抗（EarthOx公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：用促凝管采集患者清晨空腹静脉血3mL，2000r／min离心10min，收集血清，－80℃保存备用。

1.3.2 HEK293－M23－AQP4的构建：接种含有pEGFP－N1－M－23AQP4质粒的甘油菌于含硫酸卡那霉素的液体LB培养基扩增并纯化质粒，用Endo－free Plasmid Mini KitⅡ（50）抽提质粒（按说明书操作）。构建方法参考文献［8］，将HEK293细胞接种于6孔细胞培养板，待细胞长至80%～90%覆盖孔底时用磷酸钙转染试剂转染pEGFPN1－M23－AQP4质粒（按说明书操作），转染24h后，在荧光显微镜下观察，蓝光激发下观察到绿色荧光表明转染成功，将转染成功细胞按1∶10传代，用含G418（终浓度400μg／mL）培养基筛选，每3d更换G418筛选培养基，2周后挑选单克隆，用含G418（200μg／mL）培养基维持培养，获得绿色荧光较强且持续的细胞。用CBA法进行鉴定，将获得的细胞接种于经多聚赖氨酸包被的96孔细胞培养板（1×105个／孔），置37℃、5%（体积分数）CO2培养24h，PBS浸洗2min×5次，4%（质量分数）多聚甲醛固定30min，PBS浸洗2min×5次，设3个平行孔，正常山羊血清工作液（50μL／孔）室温封闭1h，去除封闭液，兔源抗人AQP4多克隆抗体（1∶100稀释，50μL／孔）4℃孵育过夜，PBS浸洗2min×5次，TRITC标记的羊抗兔二抗（1∶200稀释，50μL／孔）室温孵育1h，PBS浸洗2min×5次，50%（体积分数）甘油－0.5 mol／L pH 9.0～9.5碳酸盐缓冲液封闭，荧光显微镜下观察，蓝光（420～490nm）激发下的绿色荧光区域，经绿光（535～550nm）激发后观察到红色荧光则表明有 M23－AQP4 表 达，HEK293－M23－AQP4构建成功。同样的方法构建 HEK293－pEGFP－N1细胞，荧光显微镜下蓝光激发时出现持续可见绿色荧光表明构建成功；采用CBA法进行鉴定，若显微镜下观察到红色荧光则表明HEK293－pEGFP－N1细胞能与抗 AQP4抗体结合，若不能观察到红色荧光则表明HEK293－pEGFP－N1细胞不能与抗 AQP4抗体结合，作为HEK293－M23－AQP4细胞的对照。

1.3.3 4组患者的抗AQP4抗体检测：HEK293－M23－AQP4接种并固定于96孔细胞培养板，PBS浸洗2min×5次，正常山羊血清工作液（50μL／孔）室温封闭1h，去除封闭液，血清标本（1∶50稀释，50μL／孔，每个标本设3个孔）4℃孵育过夜，PBS浸洗2min×5次，Cy3标记的羊抗人二抗（1∶500稀释，50μL／孔）室温孵育1h，PBS浸洗2 min×5 次，50% （体积分数）甘油－0.5mol／L pH9.0～9.5碳酸盐缓冲液封闭，荧光显微镜下观察，蓝光激发下的绿色荧光区域，经绿光激发后观察到红色荧光为阳性，无红色荧光为阴性。将检测结果为阳性的血清标本用倍比稀释法稀释为1∶50～1∶1638400检测抗AQP4抗体，以不能观察到红色荧光的最小稀释比例的前一比例作为该标本的抗AQP4抗体滴度。记录并比较4组患者抗AQP4抗体阳性率，计算抗AQP4抗体诊断NMO的敏感性和特异性。阳性率＝抗体阳性例数／相应组中患者总例数；敏感性＝NMO组中抗体检测阳性例数／NMO组总例数×100%，特异性＝对照组阴性例数／对照组总例数×100%。

1.3.4 HEK293－M23－AQP4的稳定性检测：HEK293－M23－AQP4接种并固定于96孔细胞培养板，将上述96孔细胞培养板分别于室温、4℃、－20℃下保存4周后作为底物，用1.3.3方法检测经首次检测为阳性的标本及随机选取的5例阴性标本的抗AQP4抗体及滴度，比较各保存温度下所测得的抗AQP4抗体阳性率及其滴度与首次检测结果的差异，以观察HEK293－M23－AQP4的稳定性。

1.3.5 抗AQP4抗体稳定性检测：上述经首次检测抗AQP4抗体为阳性的标本及随机选取的5例阴性标本反复3次冻融后分装3份（10μL／Ep管），分别于室温、4℃、－20℃下保存1周后检测抗AQP4抗体及其滴度，比较各保存温度下所测得的抗AQP4抗体阳性率及其滴度与首次检测结果的差异，以观察血清抗AQP4抗体的稳定性。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行分析，4组血清抗AQP4抗体阳性率比较采用Fisher确切概率法，本研究中测得的血清抗AQP4抗体滴度经对数转化（Lg），采用Wilcoxon带符号秩检验进行比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HEK293－M23－AQP4构建 经 G418筛选获得的细胞，在荧光显微镜下可见蓝光激发下所发出绿色荧光定位在细胞膜（图1A），经CBA法检测显示TRITC红色荧光标记主要在细胞膜区域（图1B），表明 HEK293－M23－AQP4构建成功，M23－AQP4主要表达在细胞膜。G418筛选获得的HEK293－pEGFP－N1细胞持续表达绿色荧光，且绿色荧光充满整个细胞（图1D），CBA法未观察到红色荧光，显示FRITC羊抗兔二抗未结合（图1E），对照表明 HEK293－M23－AQP4细胞表达M23－AQP4。

2.2 4组患者抗AQP4抗体检测 以HEK293－M23－AQP4细胞为底物的CBA法检测显示，与抗AQP4抗体阳性血清标本结合时，荧光显微镜下经绿光激发可观察到红色荧光（图2B），且红色荧光与绿色荧光重叠（图2C），而与抗AQP4抗体阴性血清标本结合则不能观察到红色荧光（图2E），以HEK293－pEGFP－N1细胞为底物亦不能观察到红色荧光（图2F）。6例NMO患者血清抗AQP4抗体阳性率为83.3%（5／6），显著高于 MS患者阳性率〔6.3%（1／16），P＝0.001〕、其他脱髓鞘性疾病〔3.3%（1／30），P＜0.001〕和非脱髓鞘性疾病患者〔0.0%（0／10），P＝0.001〕；MS患者和其他脱髓鞘性疾病的阳性率差异无统计学意义（P＝0.58）；非NMO脱髓鞘疾病患者和非脱髓鞘性疾病患者抗AQP4抗体阳性率差异无统计学意义（P＝0.82）；抗AQP4抗体诊断NMO的敏感性为83.3%（5／6），以 MS作为对照时，其特异性为93.8%（15／16），以其他脱髓鞘性疾病和非NMO的脱髓鞘疾病作为对照时，其特异性分别为96.7%（29／30）、95.6%（44／46），以非脱髓鞘疾病作对照时，其诊断NMO 特异性为100% （10／10）。阳性标本抗AQP4抗体滴度在1∶400～1∶120 400之间（表1）。

2.3 HEK293－M23－AQP4稳定性检测 7例阳性标本均仍为阳性，5例阴性标本也均仍为阴性，其阳性结果未发生改变（P＝1.0）；7例阳性标本的抗AQP4抗体滴度与首次检测结果比较差异均无统计学意义（z＝0，P＝1.0，表2）。

2.4 抗AQP4抗体稳定性检测 血清标本经4℃和－20℃保存后抗AQP4抗体及其滴度与首次检测结果比较差异均无统计学意义（P＝1.0，表1），室温保存其抗AQP4抗体检测结果与首次检测结果比较差异无统计学意义（P＝1.0），但抗AQP4抗体滴度显著下降（z＝－2.64，P＜0.01）（表2）。

图1 HEK293－M23－AQP4鉴定：M23－AQP4主要在细胞膜表达，抗AQP4抗体结合在细胞膜区域（CBA法，荧光显微镜，标尺50 μm）

表1 不同保存条件下抗AQP4抗体阳性标本抗体滴度比较

图2 抗AQP4抗体检测（CBA法，荧光显微镜，标尺50μm）

表2 不同温度保存4周后的96孔细胞培养板检测阳性标本抗AQP4抗体滴度

3 讨论

本研究采用磷酸钙转染试剂将M23－AQP4基因转入HEK293细胞，经G418筛选、挑取单克隆扩增并经CBA法鉴定，最终成功构建HEK293－M23－AQP4细胞，与国内外使用较多的脂质体转染试剂相比较，磷酸钙转染试剂转染时不需要去除培养液中的血清，能减轻转染试剂对细胞的毒性，保持转染细胞的活性以利于后续稳定表达细胞的筛选。此外，磷酸钙转染试剂价格低廉且易于获得也是本研究方法的优势之一。

本研究采用以HEK293－M23－AQP4为底物的CBA法检测血清抗AQP4抗体，结果显示NMO患者血清抗 AQP4抗体阳性率〔83.3%（5／6）〕显著高于其他3组（6.3%、3.3%、0.0%），这与国内外研究［4，6－7］结果一致，表明抗 AQP4抗体是 NMO的重要生物学标记，有助于NMO与MS和脱髓鞘性疾病的鉴别诊断，也支持 Wingerchuk等［3］将抗AQP4抗体纳入NMO诊断标准。本研究方法检测抗AQP4抗体对诊断NMO的敏感性高于Lennon等［1］IIF的73%和基于 M1－AQP4亚型 CBA的70%［6］，但低于基于 M23－AQP4亚型CBA法的97%［9］，特异性高于IIF 的91%［1］，出现这些差异的可能原因为：（1）IIF存在种属差异，鼠AQP4与人AQP4可能存在抗原表位差异［8］，进而影响抗原抗体反应，降低了检测敏感性，本研究采用人M23－AQP4不存在种属差异的影响；（2）IIF采用鼠脑组织作为底物，由于存在组织AQP4表达量的差异以及AQP4抗原暴露程度的差异，组织的选取和处理对检测敏感性造成影响，本研究以稳定表达M23－AQP4的细胞为底物，AQP4表达量充足；（3）研究表明，主要由 M23－AQP4形成的正交阵列颗粒（OAPs）是抗AQP4抗体的主要识别靶点［6］，这可能是本研究敏感性高于M1－AQP4亚型CBA（70%）的原因之一；（4）样本量小可能是造成本研究敏感性低于同样基于M23－AQP4检测方法（97%）的原因；（5）IIF由于底物组织存在 AQP4之外的其他抗原，可造成抗AQP4抗体与组织的非特异性结合，从而降低特异性，本研究采用特异性表达M23－AQP4的细胞为底物，可减少非特异性结合，提高特异性。

本研究经4%（质量分数）多聚甲醛固定HEK293－M23－AQP4的96孔细胞培养板于室温、4℃和－20℃保存4周后检测血清抗AQP4抗体，结果显示抗体阳性率和滴度与首次检测结果差异无统计学意义，表明经4%（质量分数）多聚甲醛固定HEK293－M23－AQP4稳定性好，可以保存备用，这意味着本研究方法可不需要临时培养、转染以制备AQP4抗原表达细胞，可简化实验步骤、显著缩短检测耗时、降低对检测技术的要求，为不具备细胞培养和荧光显微镜等技术设备的实验室检测血清抗AQP4抗体提供可能。此外，反复冻融3次的血清标本置于室温、4℃和－20℃保存1周后用于检测血清抗AQP4抗体，结果显示阳性率以及4℃以下保存标本的抗体滴度与首次检测结果无差异，但室温保存的标本抗体滴度显著低于首次检测（P＜0.01），表明室温会加速抗AQP4抗体降解，延长保存时间可能会影响检测阳性率。反复冻融和4℃以下保存不影响检测结果，抗AQP4抗体稳定性较好，这意味着本研究方法对送检标本质量的要求较低，使得跨实验室、地区检测成为可能，为抗AQP4抗体检测的临床推广提供可能。

综上，本研究结果显示，以 HEK293－M23－AQP4为底物的CBA法检测抗AQP4抗体对诊断NMO的敏感性、特异性较高，且简便易行，有利于临床用于NMO的诊断和鉴别诊断。由于本研究样本量小，标本保存时间相对较短，今后研究将增加样本量，延长标本保存时间，探索更加合适的保存条件进一步验证，以便更好地解决临床脱髓鞘性疾病诊断和鉴别困难的难题。

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