人类Munc18－1重组质粒的构建及蛋白表达和定位

吴怡 王婧 王岚 杨卫静

Sec1／Munc18（SM）蛋白相对分子质量（Mr） 为60 000～70 000，是一类与神经递质分泌相关的亲水性蛋白质。SM蛋白能以多种结合方式与神经特异性的可溶性N－乙基马莱酰胺敏感因子（NSF）附着蛋白受体（SNARE）蛋白－Syntaxin结合，并可与SNARE复合体结合，从而参与细胞内囊泡的转运和分泌过程的调控。Munc18－1也称作p67和syntaxin结合蛋白1（STXBP1），是一种突触前膜内蛋白，是SM蛋白家族一员，由594个氨基酸构成［1］，主要参与神经突触囊泡融合蛋白复合物的形成，在突触小泡与突触前膜融合过程中起重要作用［2］。Munc18－1与syntaxin结合后，能够稳定syntaxin的闭合构象，进而参与神经递质的分泌调控。细胞内敲除Munc18－1，能够导致神经递质从突触小泡释放的功能缺失［3］，表明 Munc18－1在维持中枢神经系统的正常运转中起重要作用，这种蛋白质功能的异常可能导致脑功能紊乱的发生。本研究旨在获得人类 Munc18－1（hMunc18－1）全长基因序列及其在细胞内的表达和定位，为进一步探讨其在神经系统疾病中所扮演的角色打下基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 大肠杆菌DH5α感受态为本实验室制备，非洲绿猴肾细胞COS－7细胞系为作者实验室保存；人胎脑 MATCHMAKER cDNA文库、绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFPC1购自Clontech公司；PryobestTMDNA polymerase、dNTP、DNA购自大连TaKaRa公司；电泳凝胶回收试剂盒购自宝信生物公司；DNA marker和protein marker购自GenScript公司；T4DNA连接酶和限制性核酸内切酶BglⅡ和EcoRⅠ购自NEB公司；小鼠抗人绿色荧光蛋白（GFP）单克隆抗体购自南京金思瑞公司；HRP标记的山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL发光试剂盒购自 GE Healthcare公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司；其他试剂为国产分析纯。引物合成和DNA测序由金思瑞公司完成。

1.2 方法

1.2.1 hMunc18－1全长基因扩增及pEGFP－hMunc18－1重组质粒构建：根据设计的hMunc18－1扩增引物，以人胎脑cDNA文库中的cDNA为模板，以PCR方法扩增hMunc18－1全长基因序列。引物序列：上游引物为5′－ATTCTAAGATCTATGGCCCCCATTGGC－3′，下游引物为5′－GGTGGAGAATTCATTTTAACTGCTTATTTC－3′。对扩增出的PCR产物，进行1%（质量浓度）琼脂糖凝胶电泳，以Lambda DNA EcoRⅠ／HindⅢ标记作为DNA相对分子质量（Mr）标记，预期获得大小约1785bp的hMunc18－1序列全长。将pEGFP－C1载体和hMunc18－1PCR片段分别用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切后，以凝胶回收纯化产物。将两个片段用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，取5 μL连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态中，于37℃培养过夜。挑取单克隆菌落，接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜。用碱裂解法提取质粒DNA，用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切鉴定外源基因的插入，进行1%（质量浓度）琼脂糖凝胶电泳，以Lambda DNA EcoRⅠ／HindⅢ标记作为DNA Mr标记，预期得到大小为4700bp的载体和大小为1785bp的基因片段。同时将重组质粒pEGFP－hMunc18－1送到Invitrogen公司进行测序分析，重组质粒中的hMunc18－1测序结果与NCBI数据库中的hMunc18－1序列100%匹配，表明构建成功且没有突变产生。

1.2.2 pEGFP－hMunc18－1重组质粒表达蛋白GFP－hMunc18－1融合蛋白在 COS－7细胞的表达及定位：COS－7细胞常规培养于含10%（体积分数）胎牛血清的DMEM 培养基中，待细胞铺于6孔板时，细胞覆盖培养皿表面积的80%～90%时，根据Invitrogen公司的LipofectamineTM2000转染说明分别进行pEGFP－hMunc18－1重组质粒 及pEGFP－C1真核表达载体的转染，后者作为阴性对照。转染48h后，收集细胞提取蛋白。于收集的细胞中加入RIPA裂解液，超声5s后冰上放置30 min。4℃以12 000 g离心20min，取上清5μL进行蛋白定量。各取30μg蛋白经10% （质量浓度）SDS－PAGE凝胶分离，于4℃80V2.5h转移至PVDF膜上，5%（质量浓度）脱脂奶粉封闭3h，TBST洗膜。加入小鼠抗人GFP单克隆抗体（1∶1 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠（1∶5 000）二抗室温孵育2 h，TBST洗膜。ECL显色，发光。以 Western blot检测pEGFP－hMunc18－1重组质粒所表达融合蛋白 GFP－hMunc18－1的表达。在转染pEGFP－hMunc18－1重组质粒组预期可在Mr为94 000处出现条带，转染pEGFP－C1真核表达载体组在94 000处不能出现条带。同时以GAPDH蛋白作为阳性对照。将成功构建的pEGFP－hMunc18－1重组质粒转染到 COS－7细胞36h后，应用OLYMPUS FV1000S－SIM／IX81激光共聚焦扫描显微镜进行扫描，激发光波长为488nm，60倍镜下观察，所见细胞内绿色荧光物质即为融合蛋白GFP－hMunc18－1，并观察其所在位置。

2 结果

2.1 PCR扩增及重组真核表达质粒的构建及鉴定 将PCR扩增产物进行1%（质量浓度）琼脂糖凝胶电泳后获得约为1785bp的片段（图1）。对重组质粒pEGFP－hMunc18－1经BglⅡ和EcoRⅠ双酶切后得到约4.7kb（载体）和1785bp（基因片段）的两条条带（图2），进一步对重组质粒pEGFP－hMunc18－1进行hMunc18－1测序鉴定，结果显示与NCBI数据库中的hMunc18－1序列100%匹配。

图1 PCR扩增获得hMunc18－1的基因全长电泳图

图2 重组质粒pEGFP－hMunc18－1酶切分析结果

图3 COS－7 细胞中融合蛋白 GFP－hMunc18－1表达（Western blot）

2.2 融合蛋白 GFP－hMunc18－1在 COS－7细胞中的表达及定位 Western blot检测显示，转染pEGFP－hMunc18－1重组质粒组Mr为94 000处可出现条带（图3）；转染pEGFP－C1真核表达载体组在94 000处未出现条带，在27 000处检测到条带（GFP蛋白）在激光共聚焦显微镜下可见绿色荧光物质，主要分布在COS－7细胞的细胞质，尤其是近细胞膜处（图4）。

图4 融合蛋白 GFP－hMunc18－1在 COS－7细胞内定位：A、B分别为两个不同细胞，靠近细胞膜处细胞质处均可见绿色荧光物质（免疫荧光×60）

3 讨论

SM蛋白的突变会导致许多人类疾病，包括癫痫、炎性疾病、关节僵硬症，以及肾功能不全等。突触因子Munc18－1是最具特征的SM蛋白，目前已有报道Munc18－1的异常与一些神经系统疾病如阿尔茨海默病（AD）、癫痫等的发生密切相关。动物实验还表明Munc18－1功能异常导致的行为、神经化学、形态结构的改变与神经分裂症的表现相似，推测 Munc18－1很可能参与神经分裂症的发生［4］。

Munc18－1具有以下三方面的功能［5］：（1）作为syntaxin1的分子伴侣，保证syntaxin1的正确定位和表达；（2）通过促进SNARE复合物介导的膜融合过程启动神经细胞胞吐；（3）促进致密核心囊泡锚定到细胞膜。Munc18－1对于胞吐过程的调控存在两方面相互矛盾的作用。一方面，体外实验证实Munc18－1与syntaxin1结合可以稳定syntaxin1的折叠构象，同时还可以抑制syntaxin1与突触小泡蛋白（synaptobrevin）和Mr为25 000的突触小体相关蛋白（SNAP－25）结合形成复合物，进而负向调节神经递质的分泌。另一方面，体内证据表明Munc18－1与syntaxin1结合促进syntaxin1从高尔基复合体到内质网的转运，并且促进syntaxin1的构象改变，易于形成SNARE复合物，启动突触小泡与细胞膜的融合［6］。

Munc18－1对于富含神经递质的突触小泡与细胞膜的融合过程是必不可少的，其相互作用可能在蛋白融合过程中起至关重要的作用，有研究发现，通过磷酸化 Munc18－1，形成稳定 X11－Munc18－1－Syntaxin1复合物，此复合物进一步调节淀粉样前体蛋白（APP）的处理加工以及不溶性β－淀粉样（Aβ）蛋白的产生，参与阿尔茨海默病的病理过程［7］。目前国外学者已经对 Munc18－1的生物学功能进行了一定的研究，而国内对其研究相对较少。本文作者通过基因克隆技术成功构建了重组质粒pEGFP－hMunc18－1，并将其转染到 COS－7细胞，结果发现GFP－hMunc18－1融合蛋白主要定位在COS－7细胞的细胞质，尤其是细胞膜附近。这一定位特点与已知的hMunc18－1协助将syntaxin1输送到细胞膜的功能正好吻合。本实验的结果初步提供了Munc18－1的基本生物学功能特点，可能为进一步研究其复杂的生物学功能打下了基础。

GFP－hMunc18－1融合蛋白在 COS－7细胞中的成功表达，也有赖于转染操作的成功，由于绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP－C1分子量比较大，导致pEGFP－hMunc18－1重组质粒不易转到细胞中，因此融合蛋白表达量低，作者在研究过程中经过几次实验不断调整重组质粒DNA的转染量，当调整到LipofectamineTM2000转染说明书中所提供6孔板每孔单次可转染DNA量的半量时，即DNA（μg）∶脂质体（LipofectamineTM2000）（μL）为1∶5时，为本次实验的最优化比例，转染效率最高，此时融合蛋白表达最多。另外，PCR实验过程中需要不断调整退火温度以增加产物的特异性，作者从60℃、55℃、52℃进行不断摸索，最终选择52℃作为退火温度，此时特异性最好，即获得目的DNA的量最多，杂带少。这个实验提示作者从cDNA文库的cDNA中扩增片段，可以尝试温度梯度PCR，以便快速地找出最适合的退火温度，从而可在短时间内对PCR实验进行优化，大大提高PCR科研效率。

综上所述，本研究成功构建了pEGFP－hMunc18－1重组质粒，将为今后建立稳定表达hMunc18－1的细胞模型，进一步发现其相互作用蛋白，检测其下游靶基因的表达和活性提供了一定基础，并有助于研究 Munc18－1对神经细胞、神经系统信号转导通路的作用，同时便于研究Munc18－1在AD、癫痫等疾病中的致病机制。

［1］陈功，江澄川，程介士.神经突触前膜胞内蛋白（Munc－18）抗体慢性点燃致痫大鼠及其机制［J］.中国神经科学杂志，2004，20：248－251.

［2］陈功，江澄川，杨茹.Munc18抗体致痫机制的体外实验研究：诱导海马神经细胞的损伤［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2007，6：491－495.

［3］Verhage M，Maia AS，Plomp JJ，et al.Synaptic assembly of the brain in the absence of neurotransmitter secretion［J］.Science，2000，287（5454）：864－869.

［4］Urigüen L，Gil－Pisa I，Munarriz－Cuezva E，et al.Behavioral，neurochemical and morphological changes induced by the overexpression of munc18－1ain brain of mice：relevance to schizophrenia［J］.Transl Psychiatry，2013，3：1－10.

［5］Han GA，Bin NR，Kang SY，et al.Domain 3aof Munc18－1 plays a crucial role at the priming stage of exocytosis［J］.J Cell Sci，2013，126（11）：2361－2371.

［6］Yu H，Rathore SS，Lopez JA，et al.Comparative studies of Munc18cand Munc18－1reveal conserved and divergent mechanism of Sec1／Munc18proteins［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（35）：3271－3280.

［7］Park JH，Jung MS，Kim YS，et al.Phosphorylation of Munc18－1by Dyrk1Aregulates its interaction with Syntaxin 1and X11α［J］.J Neurochem，2012，122（5）：1081－1091.