海人酸致痫大鼠脑内白蛋白、S100B及GFAP动态表达的研究

覃维含 吴原 陈镇 刘夕霞 黄逸青

既往研究表明，癫痫发作可导致血－脑脊液屏障功能紊乱及结构破坏，对白蛋白通透性增加［1］。脑组织中较高水平白蛋白可激活星形胶质细胞，使其细胞内S100B和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达水平改变，且脑细胞损伤时，脑脊液及血清中S100B水平亦会增高［2］。S100B在中枢神经系统（central nervous system，CNS）炎性反应中起启动和维持作用。GFAP表达量与血－脑脊液屏障的形成密切相关，GFAP缺乏可导致血－脑脊液屏障形成缺陷［3］。本研究采用ELISA及免疫组化染色方法检测海人酸（kainic acid，KA）颞叶癫痫模型大鼠脑脊液白蛋白、S100B及脑组织内白蛋白、S100B及GFAP蛋白质表达的变化规律，为探讨颞叶癫痫中血－脑脊液屏障的破坏及白蛋白、S100B和GFAP与颞叶癫痫的关系积累资料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级健康雄性SD大鼠〔实验动物的使用许可证为：SCXK（桂）2009－0002〕75只，体质量（250±15）g，由广西医科大学动物实验中心提供。

1.1.2 主要试剂：白蛋白 ELISA 试剂盒（CSBE14410r，武汉华美生物工程有限公司），S100B蛋白ELISA试剂盒（CK－E30417R，苏州卡尔文生物科技有限公司），白蛋白及S100B蛋白免疫组化一抗（分别为ab106582、ab52642，英国 Abcam 公司），GFAP一抗（BA0056，武汉博士德生物工程有限公司），免疫组化二抗（sp9000，北京中衫金桥生物技术有限公司）。奥林巴斯光学显微镜（Olympus Corporation，日本）。

1.2 方法 模型组于侧脑室注射KA后6h、24 h、3d和7d，生理盐水对照组（对照组）注射等量生理盐水后6h，对动物进行观察取材。动物按上述时间点随机分为5组，每组各15只。

1.2.1 癫痫动物模型制备：参照Paxinos大鼠脑立体定位图谱定位于大鼠右侧侧脑室，坐标为前囟往后0.8mm，中线旁开1.3mm，硬膜下3.7mm，以1μL微量注射器将KA溶液（2μg／kg）缓慢注入侧脑室，控制注射速度为0.05μL／min。依据Racine分级标准将大鼠行为分为5级：Ⅰ级：面肌抽动，节律性咀嚼动作；Ⅱ 级：节律性点头或“湿狗样”抖动（wet dog shakes，WDS）；Ⅲ 级：一侧前肢阵挛；Ⅳ 级：双侧前肢阵挛伴站立；Ⅴ级：跌倒、全身强直阵挛性发作。以Ⅳ～Ⅴ级发作的大鼠作为成功癫痫模型。4个模型组共有57只大鼠造模成功纳入下一步实验，其中模型组6h15只、模型组24h14只、模型组3d14只、模型组7d14只。对照组仅于侧脑室注入等体积的生理盐水。

1.2.2 脑脊液标本采集及石蜡切片制备：以开始侧脑室注药为起点，模型组大鼠分别在相应的时间点、对照组在注射生理盐水后6h采用枕骨大孔直接穿刺法抽取脑脊液（被血液污染的脑脊液弃用），以4500r／min离心10min后取上清液储存于－20℃冰箱保存备检。将大鼠依次使用生理盐水250mL及4%（质量分数）多聚甲醛溶液250 mL进行心脏灌注，断头取脑，在大脑腹侧面的视交叉及下丘脑后区乳头体两处对其进行冠状切片，将中间包含海马部分的脑组织用4%（质量分数）多聚甲醛固定24h后，脱水透明浸蜡后用石蜡包埋、切片，片厚4μm。

1.2.3 脑脊液白蛋白及S100B浓度检测：在采集脑脊液后第二天采用双抗体夹心法（ELISA）测定脑脊液中白蛋白及S100B浓度，具体操作步骤严格参照试剂盒说明书进行。

1.2.4 脑组织白蛋白、S100B及GFAP水平检测：采用免疫组织化学法对脑组织切片进行检测，主要步骤如下：二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，柠檬酸修复液高压修复，用3%（体积分数）过氧化氢覆盖组织切片20min以消除内源性过氧化物酶，山羊血清封闭20min，分别加白蛋白（1∶40）、S100B蛋白（1∶450）、GFAP（1∶50）一抗于4℃过夜，之后置生物素化二抗工作液37℃恒温箱20min，辣根酶标记链霉卵白素工作液20min，DAB显色3～10min。于200倍光学显微镜下采集图片，观察白蛋白（表达在侧脑室室管膜、海马CA3区及第一躯体感觉皮质区）、S100B及GFAP（后两种物质表达在海马区）表达情况，使用Image－Pro Plus软件分别测量累计光密度值（integrated optical density，IOD）及阳性表达面积（area），计算平均光密度值（IOD／area比值）。平均光密度值高提示目标蛋白表达量高。DAB染色后三种目标蛋白表达均呈棕黄色。

1.2.5 HE染色了解海马CA3区结构改变：对脑组织切片常规进行HE染色，于200倍光学显微镜下采集2张海马CA3区图片观察其神经元排列及结构改变。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析。数据均采用均数±标准差（）表示。多组间比较采用one－way ANOVA法；若方差齐，组间两两比较采用LSD法，若方差不齐，则采用Welch检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑脊液白蛋白、S100B检测 结果见表1。模型组6h白蛋白水平高于对照组（P＜0.05），其余时间点与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组四个时间点白蛋白水平两两比较，模型组7d、模型组3d低于模型组6h（P＜0.05），其余时间点两两比较差异均无统计学意义。模型组4个时间点脑脊液S100B水平均高于对照组（P＜0.05）；模型组4个时间点S100B水平间两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中以模型组3d时脑脊液S100B浓度最高。

2.2 脑组织白蛋白、S100B及GFAP检测

2.2.1 侧脑室室管膜、第一躯体感觉皮质区及海马CA3区白蛋白表达：模型组及对照组大鼠侧脑室室管膜边缘均可以看到棕黄色白蛋白附着（图1）；4个模型组均有个别大鼠第一躯体感觉皮质区可见白蛋白长条或块状表达（图2）；模型组各时间点均有个别样本中观察到在CA3区有白蛋白表达，以模型组3d时最为明显（图3）。

白蛋白在海马CA3区（模型组6h、24h、7d时各2只，3d时3只）及第一躯体感觉皮质区（模型组24h时1只，6h、3d及7d时各3只）表达的大鼠数非常少，故仅对侧脑室室管膜白蛋白表达进行统计学分析。模型组4个时间点分别与对照组比较，模型组24h及模型组6h时侧脑室室管膜白蛋白表达高于对照组（P＜0.05），3d及7d时与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组四个时间点白蛋白表达两两比较，3d、7d时均低于模型组6h（P＜0.05），模型组7d时亦低于其他2个模型组（均P＜0.05）（表1）。

2.2.2 海马区S100B表达比较：模型组4个时间点海马区S100B表达均高于对照组（P＜0.05）；模型组24h、3d和7d时S100B表达均高于模型组6h时（P＜0.05），且模型组7d时低于模型组3d时（P＜0.05）（图3，表1）。各组大鼠海马齿状回均可见棕黄色S100B表达，其中模型组3dS100B表达最多，模型组7d次之（图4）。

2.2.3 海马区GFAP蛋白表达比较：模型组3d、7d时海马区GFAP表达均高于对照组（均P＜0.05），其余时间点GFAP表达与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组 3d、7d时GFAP表达均高于模型组24h与6h时（均P＜0.05），且7d时GFAP表达亦高于3d时（P＜0.05）（图5，表1）。各组大鼠海马齿状回及门区均可见棕黄色GFAP表达，模型组4个时间点较对照组增多，模型组4组随时间往后推移GFAP表达逐渐增多、染色加深（图5）。

2.3 HE染色 对照组大鼠海马CA3区细胞排列整齐，未见明显异形细胞及细胞核深染、碎裂等（图6A）。模型组6h时海马CA3区即出现神经元排列紊乱（图6B中黑箭头所示）、部分细胞核深染（图6B中白箭头所示）；模型组24h时细胞排列紊乱（图6C中黑箭头所示），由圆形改变为多形性改变（图6C中白箭头所示）；模型组3d时多数细胞形态多形性改变，细胞层次减少（图6D中箭头所示）；模型组7d时细胞排列分散、细胞坏死（图6E中箭头所示）。

表1 各组不同时间点脑脊液中白蛋白、S100B及脑组织白蛋白、S100B及GFAP表达比较 （）

表1 各组不同时间点脑脊液中白蛋白、S100B及脑组织白蛋白、S100B及GFAP表达比较 （）

注：表中n值为成功采集到脑脊液的大鼠；与对照组6h比较，＊P＜0.05；与模型组6h比较，＃P＜0.05；与模型组24h比较，▲P＜0.05；与模型组3d比较，△P＜0.05

）］模型组7d 9 138.52±31.16＃ 41.37±3.14＊＃▲△ 0.335±0.002＃▲△ 0.341±0.007＊＃△ 0.351±0.024＊＃▲△组别 n 脑脊液白蛋白（μg／mL） S100B（pg／mL） 脑组织（IOD／area）白蛋白［lg（1／trans）］ S100B［lg（1／trans）］ GFAP［lg（1／trans模型组3d 7 150.42±39.71＃ 68.50±5.63＊＃▲ 0.345±0.003＃ 0.366±0.015＊＃ 0.306±0.026＊＃▲模型组24h 8 153.19±34.80 49.08±2.79＊＃ 0.350±0.005＊ 0.353±0.025＊＃ 0.243±0.011模型组6h 8 188.75±42.87＊ 36.60±2.77＊ 0.352±0.004＊ 0.304±0.023＊ 0.232±0.009对照组6h 10 127.45±28.32 31.60±3.55 0.338±0.009 0.268±0.013 0.231±0.012 F值0.007 0.000 0.000 0.000 0.0 4.12 121.58 10.24 44.49 60.82 P值

图1 各组大鼠侧脑室白蛋白（图中箭头所示）表达（免疫组化×200）图2 各组大鼠第一躯体感觉皮质区白蛋白（图中箭头所示）表达（免疫组化×200）

图3 各模型组大鼠海马CA3区白蛋白（图中箭头所示）表达（免疫组化×200）

图4 各组大鼠海马齿状回S100B（图中箭头所示）表达（免疫组化×200）图5 各组大鼠海马齿状回及门区GFAP（箭头所示）表达（免疫组化×200）图6 各组大鼠海马CA3区形态改变（HE×200）：神经元排列紊乱（图B中黑箭头所示）、部分细胞核深染（图B中白箭头所示）；模型组24h细胞排列紊乱（图C中黑箭头所示），由圆形改变为多形性改变（图C中白箭头所示）；模型组3d时多数细胞形态多形性改变，细胞层次减少（图D中箭头所示）；模型组7d时细胞排列分散、细胞坏死（图E中箭头所示）

3 讨论

正常情况下，血－脑脊液屏障对白蛋白的通透性很小。癫痫发作可导致血－脑脊液屏障损伤，使其对白蛋白的通透性增高，损伤程度与癫痫发作形式及疾病分期密切相关，癫痫持续状态（status epilepticus，SE）及癫痫急性期血－脑脊液屏障损伤更加严重，白蛋白在海马等脑区的表达更多、分布更广泛［4］。

脑内白蛋白可通过转化生长因子β（TGF－β）信号传导通路激活星形胶质细胞，并激活脑内先天性免疫系统，干扰细胞外钾离子及谷氨酸平衡，使神经元兴奋性增高、神经网络改变［5］。Ivens等［6］曾报道将脑组织直接暴露在白蛋白中也可诱导癫痫发作。另有研究显示，在癫痫相关性神经节细胞胶质瘤的胶质细胞中可观察到大量白蛋白被摄取，而病灶周围星形胶质细胞对白蛋白的摄取非常少［6］，提示血－脑脊液屏障功能障碍和白蛋白在星形胶质细胞中累积可能是癫痫新的致痫机制。在本研究中，模型组6h时癫痫大鼠脑脊液白蛋白高于对照组，白蛋白在各模型组个别大鼠第一躯体感觉皮质及海马CA3区异常沉积，CA3区神经元结构及排列改变、坏死等，也提示癫痫发作可以造成血－脑脊液屏障损伤，脑内白蛋白异常出现对神经元有一定损伤作用。模型组6h、模型组24h脑脊液及脑组织中白蛋白均高于对照组，之后白蛋白表达逐渐减少，3d、7d时与对照组差异无统计学意义，提示首次癫痫发作对血－脑脊液屏障的结构和功能造成的损伤可能是一过性的。

在CNS中S100B主要由血管外周的成熟星形胶质细胞分泌，当细胞损伤及血－脑脊液屏障损害时，脑脊液及血清中S100B水平增高，前者尤为显著［2］，且血清、脑脊液中S100B水平可先于脑内压、神经影像以及神经病理改变前发生变化。Zongo等［7］通过比较分析头部轻微创伤患者的CT扫描结果和血清S100B水平发现，血清S100B＜0.12ng／mL的患者脑内出现明显影像学改变或者严重后遗症的风险很小。癫痫发作时星形胶质细胞可加倍合成S100B蛋白，高水平S100B具有高度神经胶质激活和促进神经炎性反应损伤的作用，刺激自身及小胶质细胞产生大量的炎性因子及一氧化氮（NO），导致神经元功能障碍。蜂肽毒可通过与S100B分子内部参与钙离子结合的氨基酸残基的相互作用干扰S100B在癫痫发作中的作用，被作为治疗癫痫的药物之一［8］。本研究中，模型组四个时间点癫痫大鼠脑脊液及海马区S100B表达均高于对照组，海马CA3区神经元变性、坏死且数量减少，提示癫痫发作可能导致脑损伤，高水平S100B可能通过促进炎性反应加重了神经元损伤，其可能原因为癫痫发作不仅可以激活星形胶质细胞，而且可以破坏星形胶质细胞及血－脑脊液屏障，使脑脊液及脑组织S100B含量增高。

GFAP是星形胶质细胞的骨架蛋白及特异性标志物。有实验研究表明，GFAP缺如条件下小鼠对脑缺血损伤具有更高的敏感性，同时诱导血－脑脊液屏障形成过程存在缺陷［3］，提示GFAP对脑损伤具有保护作用，且对血－脑脊液屏障完整性形成具有重要作用。GFAP＋／＋星形胶质细胞可以诱导非神经源性内皮细胞对K＋（钾离子）、14C蔗糖及8磺茶碱（8－SPT）选择性通透［9］。在 GFAP－／－小鼠，脊髓和视神经的血－脑脊液屏障结构单薄，血管数目减少、发育不良，对125碘－（125I－）标记的白蛋白的通透性明显增加［10］。本研究中，模型组3d及7 d时癫痫大鼠海马区GFAP水平高于对照组，提示癫痫发作后星形胶质细胞可能通过上调GFAP表达水平降低脑对缺血缺氧的敏感性及对损伤的血－脑脊液屏障进行修复。癫痫发作后大鼠海马区GFAP表达随着时间的推移逐渐增多，提示癫痫发作后星形胶质细胞活化、增生程度增强。

综上可见，癫痫发作后大鼠脑组织中白蛋白、S100B及GFAP表达异常增高。白蛋白为脑外源性物质，在血－脑脊液屏障损伤时即可通过血－脑脊液屏障，故脑脊液及脑组织中白蛋白水平变化快，而S100B及GFAP由星形胶质细胞产生及分泌，两者的半衰期不同，因此在脑脊液或脑组织中水平增高时间点不同。但白蛋白、S100B及GFAP在癫痫发病机制中的具体作用亟待进一步研究。

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