20株木腐菌高产漆酶菌株的筛选

刘卉娟等

摘要：采用PDA-苯胺蓝显示法检测了20株木腐菌的产漆酶特性，初筛选出8株产漆酶菌株，通过液体发酵培养进一步检测其漆酶活性。结果显示，能够产生漆酶的菌株中只有6株检测到漆酶活性，其中SWFC9938产漆酶能力最强，最高平均酶活性可达1 656.82 U/mL，为高产漆酶菌株。Cu2+和藜芦醇诱导能显著提高SWFC9938的产酶能力，最高平均酶活性分别可达2 485.10和2 454.24 U/mL。藜芦醇能明显缩短最高产酶的发酵时间，发酵8 d时即出现酶活性高峰（对照出现在12 d以后），藜芦醇对SWFC9938菌株具有很好的诱导产酶活性。

关键词：木腐菌；漆酶；菌株筛选；诱导培养

中图分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-2858-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.012

The Screening on the High Production of Laccase from 20 Wood-rotting Fungi

LIU Hui-Juan，AO Xin-yu，HONG Hai-di，YANG Yan-xian，CHEN Yu-hui

（College Of Life Science， Southwest Forestry University， Kunming 650224， Yunnan，China）

Abstract： Used PDA-aniline blue display method to detect the 20 strains producing laccase properties of wood rotting fungi，selected 8 strains producing laccase strains and developed further testing the laccase activity by liquid fermentation. The results showed that，the crude laccase which liquid fermentation among six potential strains exhibited high catalytic activity and the highest laccase activity approximated 1 656.82 U/mL for SWFC 9938. It was found that copper and veratryl alcohol were the best laccase inducers for strain SWFC 9938 with 2 485.10 U/mL and 2 454.24 U/mL respectively. Veratryl alcohol could obviously shorten the fermentation time of the maximum enzyme production，the maximum laccase activity appeared at 8 days cultivation （the maximum laccase activity of control material was at 12 days cultivation）， indicating that veratryl alcohol might be laccase-induced potential.

Key words： wood rotting fungi；laccase；strains screening；induction training

木质素是一种以苯丙烷为基本结构单元构成的芳香族高分子化合物，为植物主要组成成分之一。木质素在植物组织中与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋其中，形成一种坚固的天然屏障，使一般微生物及其酶很难侵染和进入，从而导致木质素的降解成为地球生物圈中碳素循环的主要障碍[1]。自然界参与降解木质素的微生物有真菌、放线菌和细菌等，但已知的惟一能广泛降解木质素的生物是真菌[2]。因此从真菌中筛选高产木质素降解酶的菌株对实现木质素的降解具有重要意义。木质素降解需要木质素降解酶，木质素降解酶有3种，即木质素过氧化物酶（Lip）、锰依赖性过氧化物酶（Mnp）和漆酶（Laccase）[3]。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶（EC1.10.3.2），广泛存在于真菌中。由于漆酶作用底物广泛，包括酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾体激素和生物色素、金属有机化合物等。因此被广泛应用于木质素降解、生物制浆与漂白、染料脱色、含酚废水检测及处理、生物传感等方面[4]。漆酶降解木质素流程简单，不需要H2O2和其他次级代谢产物的参与，克服了H2O2极易分解的难题，具有更大的实际应用价值[5]，因此受到广泛关注。

本研究对采自云南、广西、江西、浙江等地的20株隶属于12个属的木腐菌进行筛选，旨在了解其产酶特性并从中获得高产漆酶菌株，为其开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

20株供试菌株由西南林业大学提供，菌株的种类及来源分别为：裂褶菌（Schizophyllum commune），编号SWFC9967，采自云南西双版纳。齿贝栓菌（Trametes cervina），编号SWFC10288，采自云南大理。彩绒革盖菌（Coriolus versicolor），编号SWFC8557；毛栓菌（Trametes hirsuta），编号SWFC8755；褐蝶（Polystictus pterygodes），编号SWFC9215，采自云南思茅。白囊孔菌（Hirschioporus lacteus），编号SWFC8298；烟色血革菌（Haematostereum gausapatum），编号SWFC8345；粗毛韧革菌（Stereum hirsutum），编号SWFC8751，采自云南昆明。厚血革菌（Haematostereum australe），编号SWFC11058；红缘拟层孔菌（Fomitopsis pinicola），编号SWFC11177；裂褶菌（Schizophyllum commune），编号SWFC11392a；软线囊孔菌（Hirschioporus vellereus），编号SWFC11396；裂拟迷孔菌（Daedaleopsis confragosa），编号SWFC11431；木蹄层孔菌（Fomes fomentarius），编号SWFC11453；褐盖韧革菌（Stereum vibrans），编号SWFC11696；薄刷革菌（Stereum radiatofissum），编号SWFC11667，采自云南丽江。彩绒革盖菌（Coriolus versicolor），编号SWFC9938，采自广西南宁。黑壳针层孔菌（Phellinus rhabarinus），编号SWFC10046，采自广西上思。血红密孔菌（Pycnoporus sanguieues），编号SWFC11044，采自江西玉山。绒毛栓菌（Tramets pubescens），编号SWFC11160，采自浙江杭州。

1.2 培养基

1.2.1 活化培养基 选择PDA培养基用作活化培养基。

1.2.2 筛选培养基 在PDA培养基中按0.1 g/L的比例加入苯胺蓝，制备成PDA-苯胺蓝培养基[6]，用作筛选培养基。

1.2.3 液体发酵培养基 采用PD培养基为基本培养基，分别加入20 mg/L CuSO4·5H2O和2 mmol/L藜芦醇构成Cu2+诱导培养基和藜芦醇诱导培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 供试菌株的活化培养 从存放于4 ℃冰箱的试管中挑出供试菌株，接种于PDA培养基上，在（28±2） ℃条件下培养至菌落长满培养皿备用。

1.3.2 产漆酶菌株初筛 采用PDA-苯胺蓝显色试验进行菌株产漆酶初筛[7]。用12 mm无菌打孔器切取PDA平板上培养好的菌落，接种至PDA-苯胺蓝平板上并置于（28±2） ℃条件下培养10 d，每天定时观察记录菌落周围有无变色现象产生，有记为“+”，无记为“-”。最后根据所产棕色氧化圈的大小，初步筛选出产漆酶的菌株。每一菌株设3个重复。

1.4 产漆酶菌株的复筛

1.4.1 粗酶液的制备 将初筛获得的产漆酶菌株采用PDA平板培养， 待长满平板后，用12 mm的无菌打孔器切取培养皿外圈的菌落，分别接入PD和诱导培养基中，每瓶接种3个菌片， 于（28±2） ℃、130 r/min条件下振荡培养16 d并从第4天开始每间隔2 d取样1次。培养液经8层纱布过滤，4 ℃、 6 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液[8]。

1.4.2 漆酶活性测定 采用 ABTS[2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐]法测定粗酶液中漆酶的活性[9]。在含0.5 mmol/L ABTS的0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.0） 2 mL中，加入1 mL酶液后启动反应，在420 nm波长下测定反应的前3 min内反应液的吸光度变化。以1 mL酶液加0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.0）2 mL做空白对照。以每分钟使 1 μmol/L ABTS被转化所需的酶量为1个酶活力单位。

2 结果与分析

2.1 初筛结果

20株木腐菌在PDA-苯胺蓝显色平板上培养时培养基的颜色变化的结果如表1所示。由表1可知，20个供试菌株中，有12个菌株在整个培养过程中培养基颜色始终保持不变，表明这些菌株在漆酶初筛培养基（PDA-苯胺蓝）上生长时不能产生漆酶。另有8个菌株在漆酶初筛培养基上生长至第2天时菌落周围的培养基的颜色便开始出现了变化，并随着培养时间的延长，培养基上出现明显的棕色氧化圈且氧化圈逐渐增大，表明这些菌株在漆酶初筛培养基上生长时能够产生漆酶，为产漆酶菌株。8个产漆酶菌株分别为SWFC8557、SWFC8755、SWFC 9938、SWFC10288、SWFC11160、SWFC11392a、SWF

C11396和SWFC11431。

2.2 复筛结果

2.2.1 8株产漆酶菌株在基本培养基中培养时产漆酶的能力 对初筛获得的8株产漆酶木腐菌菌株进行复筛，采用液体发酵的方法进行筛选，结果如表2所示。由表2可知，8株供试菌株在基本培养基发酵培养条件下，不同菌株产漆酶能力存在很大差异。8株菌株中有2株菌株（SWFC11160和SWFC11431）在整个培养过程中发酵液仅检测到微弱的漆酶活性，而其他6株菌在培养过程中检测到较强的漆酶活性，但不同菌株所产漆酶活性的大小和出现酶活性高峰的时间存在明显差异。6株菌株中在不同培养时间内产漆酶能力最强的菌株为SWFC 9938，其最大平均酶活性超过1 600 U/mL（12 d和14 d），其次为SWFC8557和SWFC11392a菌株，其最大平均酶活性分别达到935.99（16 d）和694.59 U/mL（14 d）。而菌株SWFC8755和SWFC11396产漆酶能力则相对较差，其最高平均酶活性仅分别达到48.33和63.78 U/mL，但产酶高峰出现较早，均出现在培养的第6天，随后酶活性则逐渐下降，其中以SWFC11396菌株尤为明显。

2.2.2 诱导剂（Cu2+诱和藜芦醇）对8株木腐菌产漆酶的影响 采用Cu2+诱导培养基和藜芦醇诱导培养基对初筛获得的8株产漆酶木腐菌进行液体发酵培养，通过测定发酵液中漆酶活性以考察诱导剂Cu2+和藜芦醇对供试菌株产漆酶的影响，结果如表3和表4所示。由表3和表4可知，两种诱导剂对不同菌株产漆酶的影响不同。Cu2+和藜芦醇不能对在基础培养基（对照）中几乎不产漆酶的菌株SWFC 11160和SWFC11431产生影响，即两种诱导剂均不能诱导其产生漆酶，但却能对在基础培养基中能够产漆酶的菌株的产酶能力造成不同程度的影响。Cu2+对产酶较弱的SWFC11396菌株的产漆酶能力影响不大，并在一定程度上抑制了SWFC8755菌株的产酶能力，而藜芦醇则可提高SWFC8755菌株的产酶能力，但却抑制SWFC11396的产酶能力。

两种诱导剂对产漆酶能力相对较好的3株菌株（SWFC11392a、SWFC8557和 SWFC10288）产酶的影响主要表现为可缩短酶活高峰出现的时间，一般可缩短4～6 d，同时两种诱导剂对酶活性的影响则表现出Cu2+的诱导活性高于藜芦醇的诱导活性（图1，图2和图3）。在6株液体发酵产漆酶菌株中，受两种诱导剂影响最大的是产漆酶能力最强的SWFC9938菌株，两种诱导剂均能提高其产漆酶能力（图4）。在培养的前12 d内，Cu2+对其产漆酶的影响不大，漆酶活性与对照相比差异较小，但当培养时间超过12 d后，漆酶活性迅速升高，最高平均酶活达到2 485.10 U/mL（16 d），较对照最高平均酶活（1 656.82 U/mL）提高了50%；而藜芦醇则在整个培养过程中漆酶活性均高于对照且酶活高峰前移，在培养的前8 d酶活性升高迅速，第8天时达到酶活高峰（对照酶活高峰出现在第12天），漆酶活性达到2 454.24 U/mL，较对照第8天时的平均酶活（849.47 U/mL）提高了189%。

3 小结与讨论

对20株木腐菌首先采用PDA-苯胺蓝筛选平板进行初筛，结果显示有8个菌株能够产生漆酶，分别为SWFC8557、SWFC8755、SWFC9938、SWFC 10288、SWFC11160、SWFC11392a、SWFC11396和

SWFC11431。采用液体发酵培养时，无论有无诱导剂存在均只在6株菌的发酵液中检测到漆酶活性，其中漆酶活性最高的为SWFC9938，为高产漆酶菌株；其次为SWFC8557和SWFC11392a。6株产漆酶菌株的产酶能力大小为：SWFC9938>SWFC11392a、SWFC8557>SWFC10288>SWFC11396、SWFC8755>SWFC11431、SWFC11160。

Cu2+和藜芦醇是常用的木质素降解酶诱导剂，研究结果显示，两种诱导剂对产漆酶菌株的产酶诱导活性存在一定差异。相比而言，Cu2+的诱导活性普遍高于藜芦醇的诱导活性，而藜芦醇诱导几乎都能使产酶高峰提前，不同菌株的最适诱导剂存在差异。

本研究筛选获得的SWFC9938菌株的产漆酶能力远远超过其他菌株，且在两种诱导培养条件下产酶能力明显提高，其中以藜芦醇的诱导作用最好，培养8 d时产酶量便可达到最大，酶活性达到2 454.24 U/mL。藜芦醇可明显缩短SWFC9938产酶发酵时间，是一种较为理想的诱导剂。

同种不同来源的木腐菌在人工培养条件下产漆酶能力存在很大差异。SWFC8557和SWFC9938同为彩绒革盖菌（Coriolus versicolor），而SWFC9967和SWFC11392a则同为裂褶菌（Schizophyllum commune），但其来源地不同，产漆酶的能力也明显不同。SWFC9938在人工培养条件下的产漆酶能力远高于SWFC8557，而SWFC11392a在人工培养条件下具有产漆酶能力，但SWFC9967则无产漆酶能力。所以对不同来源的同种木腐菌进行筛选是非常必要的，而究竟是什么原因导致出现产酶能力的差异值得进一步深入研究。

本研究中的高产漆酶菌株SWFC9938为彩绒革盖菌，属于白腐菌的一种。白腐菌具有特殊的代谢类型及独有的细胞外降解特性，能降解各种生物难降解的有机污染物而成为近年来国内外研究的热点[10]。由于白腐菌是漆酶的主要产生菌，因此从自然界白腐菌中筛选新的高性能产酶菌株是解决漆酶资源短缺的一条重要途径[11-13]。然而真正在自然生长条件下具有很高漆酶活性产量的菌株并不多，能够筛选到优良自然突变体的机会也更小[14]，这就增加了菌种筛选的难度。郭梅等[15]研究发现彩绒革盖菌是产漆酶的菌株。Youn等[16]在研究白腐菌产漆酶在木质素降解中的作用时，也证实彩绒革盖菌是漆酶的高产菌。由于菌种不同来源的差异，各个菌株之间营养条件和生长条件有所不同，产生漆酶的能力也不同，有关SWFC9938菌株在人工培养下的最佳产酶条件尚有待进一步研究。

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