高产漆酶白腐真菌的筛选

王玉俊+樊忠慧+王长宝+岳丽红

摘要：以6种白腐真菌作为供试菌株，5种食用菌作为对照菌株，采用愈创木酚及α-萘酚基质平板显色法，依据漆酶催化氧化还原反应产生显色圈的直径大小及变色程度对产漆酶菌株进行初筛；并采用ABTS酶活力测定法对菌株进行复筛。结果表明，11种真菌均具有分泌漆酶的能力，得到5株高产漆酶的白腐真菌菌株，由强至弱排列依次为朱红栓菌[Trametes cinnabarina（Jacq.∶Fr.）Fr]、木蹄层孔菌[Pyropolyporus fomentarius（L. Ex F.）Teng]、单色云芝[Coriolus unicolor（L.∶Fr.）Pat]、轮纹韧革菌[Stereum ostrea（Bl. et Nees） Fr.]和寬鳞棱孔菌[Favolus squamosus（Huds.ex Fr.）Ames]，酶活力分别为23.47、20.26、19.52、18.39、17.93 U/mL。

关键词：白腐真菌；漆酶；显色直径；酶活力

中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）21-4043-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.21.012

Screening of White Rot Fungi with High Laccase Yield

WANG Yu-jun，FAN Zhong-hui，WANG Chang-bao，YUE Li-hong

（College of Life Science，Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）

Abstract： With 6 kinds white rot fungi as test strains and 5 kinds edible fungi as control strain，the method of plate substrate chromogenic of Guaiacol and α-naphthol were adopted，the diameter of chromogenic and the degree of discoloration were compared，the secrete laccase strains were screened preliminary. And strains were screened for the second time by the method of ABTS laccase activity determination. The results showed that all kinds of fungi had the ability to secrete laccase. 5 strains of high yield laccase white rot fungi were obtained，and the rank（from high to low） of these 5 kinds of fungi on the laccase activity were Trametes cinnabarina，Pyropolyporus fomentarius，Coriolus unicolor，Stereum ostrea and Favolus squamosus，enzyme activities were 23.47 U/mL，20.26 U/mL，19.52 U/mL，18.39 U/mL，17.93 U/mL，respectively.

Key words： white rot fungi； laccase； chromogenic diameter； enzyme activity

漆酶能够体外催化O-和P-联苯酚、多酚、芳香胺、苯硫醇和酚类染料等的氧化反应，降解多环芳烃、木质素能力较强，在纸浆生物漂白、废水处理、苯氧基类除草剂去毒等领域具有广泛的研究和应用价值[1-5]。实际应用于生产的漆酶主要来源于白腐真菌，从白腐真菌中筛选出高产漆酶菌株对实现木质素的降解至关重要[6，7]。本试验以6种白腐真菌作为供试菌株，5种食用菌作对照菌株，选用愈创木酚及α-萘酚基质为选择性培养基，并通过ABTS酶活力测定试验，筛选出高产漆酶优良菌株，为深入高产漆酶真菌的工业化开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种 朱红栓菌[Trametes cinnabarina （Jacq.∶Fr.）Fr]、木蹄层孔菌[Pyropolyporus fomentarius（L. Ex F.）Teng]、宽鳞棱孔菌[Favolus squamosus（Huds.ex Fr.）Ames]、轮纹韧革菌[Stereum ostrea（Bl. et Nees） Fr.]、单色云芝[Coriolus unicolor（L.∶Fr.）Pat]和平盖灵芝[Ganoderma applanatum（Pers）Pat]，采集于黑龙江省凉水国家级自然保护区；蟹味菇[Hypsizygus marmoreus （Peck） H.E.Bigelow]、平菇[Pleurotusostreatus（Jacq ex Fr.）Quel]、杏鲍菇[Pleurotus eryngii （DC.ex.Fr.）Quel]、金针菇[Flammulina velutiper（Fr.）Sing]和滑子蘑[Pholiota nameko （Ito ex Imai）]，超市购买后纯化分离。菌株均保存在佳木斯大学。

1.1.2 主要仪器 高压蒸气灭菌锅（浙江新丰高压灭菌锅），303-1A培养箱（上海沪粤明科学仪器有限公司），DK-500水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），752N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。endprint

1.1.3 药品 葡萄糖（天津市凯通化学试剂有限公司），愈创木酚（天津市光复精细化工研究所），α-萘酚（上海展云化工有限公司），ABTS（酷尔化学科技有限公司）。

1.1.4 培养基 ①PDA培养基。马铃薯200 g，葡萄糖15 g，琼脂15 g，用去离子水定容至1 L；②液体发酵培养基。马铃薯200 g，葡萄糖15 g，用去离子水定容至1 L；③0.03%愈创木酚-PDA培养基。1 L PDA培养基中加入0.3 g愈创木酚；④α-萘酚-PDA培养基。1 L PDA培养基中加入0.3 g α-萘酚。分装于200 mL锥形瓶中，121 ℃下高压蒸气灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 產酶菌株的初步筛选 用打孔器分别取1.0 cm生长7 d的11种菌株接种于0.03%愈创木酚-PDA培养基上，28 ℃下培养7 d，菌落周围呈红褐色者为产酶阳性菌株，记录与培养时间相对应的显色直径；用打孔器分别取1.0 cm生长7 d的11种菌株接种于α-萘酚-PDA培养基上，28 ℃培养7 d，菌落周围呈蓝色者为漆酶产生菌，记录与培养时间相对应的显色直径。

1.2.2 高产酶白腐菌株的复筛 用打孔器分别取1.0 cm生长5 d的11种菌株接种于100 mL液体发酵培养基中，于28 ℃振荡培养5 d后，过滤培养基，弃去滤渣。取2 mL滤液，加入2 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 5.0）和2 mL浓度为0.5 mol/L的ABTS。35 ℃下应用可见紫外分光光度计检测420 nm波长处吸收值的变化，10 s间隔读数，记录1 min内吸收值的变化量，每种真菌进行3次平行重复，并计算漆酶活力（公式1）。在一定条件下，1 min内氧化1 μmol底物所需要的酶量为1个酶活单位（U）。

E=■ （1）

式中，E为酶活力，单位为μmol/（L·min）即U/mL，A1、A2为吸光度值变化的两个端值，t为吸光度值从A1至A2所经历的时间，K为稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 愈创木酚-PDA培养基显色圈直径比较

在其他条件一致的情况下，11种真菌在愈创木酚-PDA培养基平皿上培养7 d后，均有一定程度的显色反应，显色圈呈红色，说明均具有分泌漆酶的能力，但显色直径及变色程度存在明显差异（图1）。显色圈直径大于5 cm的菌株有5个，由大到小排列依次为朱红栓菌、木蹄层孔菌、宽鳞棱孔菌、轮纹韧革菌、单色云芝，其直径分别为6.81、6.59、6.27、6.21、5.77 cm。

2.2 α-萘酚-PDA培养基显色圈直径比较

经过7 d的培养，11种真菌菌落周围均形成不同直径的蓝色透明圈，说明均可分泌出漆酶（图2）。显色圈直径较大的菌株（大于6 cm）有6个，由大到小排列依次为朱红栓菌、木蹄层孔菌、平菇、轮纹韧革菌、单色云芝、宽鳞棱孔菌，其直径分别为10.00、8.70、8.18、7.39、7.22、6.71 cm。

2.3 漆酶酶活力的比较

11种真菌均具有一定的分解ABTS的能力（图3），漆酶活力最高的是朱红栓菌，酶活力为23.47 U/mL，其次为木蹄层孔菌、轮纹韧革菌、单色云芝、宽鳞棱孔菌，酶活力依次为20.26、19.52、18.39、17.93 U/mL。以上5株白腐真菌产漆酶能力较强，而对照菌株产漆酶能力则相对较弱。

3 小结与讨论

平皿显色圈法是一种直观、快速、灵敏的检测漆酶活力的方法，一定程度上辅助了高产漆酶菌株的鉴别；漆酶可将ABTS分解为ABTS自由基，随着ABTS自由基的增加，420 nm波长处吸光值也逐渐增大，根据420 nm波长处的紫外吸光值的检测比较11种真菌所分泌漆酶的酶活力，ABTS漆酶酶活测定法灵敏度高，本试验采用ABTS法进一步检测真菌菌株产漆酶能力。朱红栓菌、木蹄层孔菌、轮纹韧革菌、单色云芝和宽鳞棱孔菌在愈创木酚-PDA培养基和α-萘酚-PDA培养基上培养过程中，生长速度较快，显色圈直径较大，变色程度明显，性状比较稳定，它们产漆酶的能力远远超过其他菌株，分解ABTS速度较快。这5种白腐真菌分泌漆酶的酶活力均高于17.0 U/mL，其中，筛选的朱红栓菌漆酶活力达23.47 U/mL，有研究报道[8]筛选的木腐菌株最高产漆酶能力为20.3 U/mL，朱红栓菌产漆酶的能力高出前人报道菌株的15.6%。说明这5种白腐真菌产漆酶能力较强，在工业化应用方面，可作为高产漆酶菌株进行规模化培养，为今后高产漆酶真菌诱变育种及工程菌株的深入研究提供理论依据。

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