产漆酶真菌的筛选及发酵产酶条件的优化

王雪 刘太林 杨焜梅 王志成 湛莹 薛兆淞 李永佳

摘 要：从4种白腐真菌（金针菇Flammulina velutipes、秀珍菇Pleurotus geesteranus、鸡腿菇Coprinus comatus、黑木耳Auriculariaheimuer）中通过愈创木酚与漆酶形成显色圈时间、大小、颜色深浅的方式筛选出产漆酶能力最强的菌株为金针菇。研究了碳源、氮源、各种理化因素等培养条件对漆酶分泌的影响，并通过正交实验设计优化产酶条件。单因素结果表明：pH为5时，漆酶分泌最高，酶活分别为235U/mL;培养温度28°C时，漆酶分泌最高，酶活分别为269U/mL;培养时间7d，漆酶分泌最高，酶活分别为311U/mL;蔗糖作碳源、豆粕作氮源，且碳氮总量不变时，碳氮比为10∶1时漆酶分泌最高，酶活为309U/mL。正交试验表明：蔗糖10g/L，豆粕1g/L，在250mL的三角瓶中，pH为6，温度28°C时，金针菇在第5天达产酶高峰，峰值酶活为330U/mL。

关键词：漆酶;筛选;金针菇;培养条件

中图分类号  TQ92文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）23-0031-04

Screening of Laccase-producing Fungi and Optimization of Fermentation Conditions for Fermentation

Wang Xue et al.

（Food Engineering College，Tianshi College，Tianjin 301700，China）

Abstract：From four species of white rot fungi，Flammulina velutipes，Pleurotus geesteranus，Coprinus comatus，Auriculariaiaheimuer，the strains with the highest laccase production capacity were selected as Flammulina velutipes by comparing the formation cycle time，size and color of guaiacol and laccase.The effects of culture conditions such as carbon source，nitrogen source and various physical and chemical factors on laccase secretion were studied，and the conditions for enzyme production were optimized by orthogonal experimental design. The single factor results showed that the laccase secretion was the highest at pH 5 and the enzyme activity was 235 U/mL. The laccase secretionwas the highest at 28°C，and the enzyme activity was 269 U/mL. The laccase secretion was reached at 7 days. The peak activity was 311 U/mL;sucrose was used as carbon source and soybean meal was used as nitrogen source. When the total carbon and nitrogen specific gravity was unchanged，the laccase secretion was the highest at 10：1，and the enzyme activity was 309 U/mL. Orthogonal test showed that：sucrose 10g/L，soybean meal 1g/L，in a 250mL volumetric flask，pH is 6，the temperature of 28 °C，Flammulina velutipes reached the peak of enzyme production on the 5th，the peak enzyme activity was 330U/mL.

Key words：Laccase;Screening;Flammulina velutipes;Culture conditions

漆酶最早是在漆樹的液汁中发现的，在分类中属于多酚氧化酶，蛋白分子中含铜元素，属于蓝铜家族氧化酶。与植物Vc氧化酶、哺乳动物血浆铜蓝蛋白、胆红素氧化酶等同属1种氧化酶家族[1-3]。漆酶能催化木质素和含酚类化合物的降解、高分子化合物的合成。漆酶特有的铜离子能够在氧化还原反应中传递电子，使漆酶具有了较强的氧化还原能力。漆酶能与木质素、胺类化合物、芳香化合物等底物发生作用，且大多数反应的唯一产物为水[4-6]，所以在食品工业、环保工业、造纸工业等领域都需要大量低成本高活力的漆酶[7]。漆酶普遍存在于白腐真菌中，是白腐真菌木素降解酶系的重要组成部分之一[8]。在自然界中大部分白腐真菌的产漆酶能力都较低且根据试验得知不同培养基的不同底物浓度、温度、pH、发酵时间产漆酶能力也有很大的差异[9]。

我们对常见的白腐真菌（金针菇、秀珍菇、鸡腿菇、黑木耳）进行了漆酶活力的初步测定，筛选出一株白腐菌漆酶高产菌株，并对其产生漆酶的条件进行了初步研究，确定了最优发酵生产漆酶的条件，以期为企业生产提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器 菌种：金针菇、秀珍菇、鸡腿菇、黑木耳，购于滨海利农菌业，经天津天狮学院生物工程实验中心扩大培养用于实验。

试剂：愈创木酚（2-甲氧基酚）购于国药集团化学试剂有限公司;蔗糖、葡萄糖、琼脂粉购于天津市风船化学试剂科技有限公司;土豆、豆粕购于沃尔玛超市。

仪器：赛多利斯天平BSA124S，德国产;恒温培养摇床HNY-200B，天津欧诺产;紫外可见分光光度计UV1000，上海天美产;台式高速离心机TG16K-II，长沙东旺产;高压蒸汽灭菌锅MJ-78Q，上海施都凯产;超净工作台SW-CJ-2G，苏州净化产。

1.2 试验方法

1.2.1 液体培养基的制备 将1L去离子水倒入电磁炉中，加入200g土豆，大火煮沸后温火煮20min，8层纱布过滤，用蒸馏水定容至1L。加入葡萄糖20g，pH调到6.0作为基本培养基。根据试验设计的需要，在基本培养基中添加不同蔗糖、豆粕作为碳源和氮源。

1.2.2 菌种培养 将4种斜面菌种接种到综合PDA平板上25°C活化培养14d。在超净台下，用打孔器取长势一致的菌丝，接种于液体培养基中，于25°C、180r/min摇瓶培养8d，收集菌丝体悬液作为液体菌种。接种时，在超净台下用移液枪精确吸取2mL加入到不同试验组，在25°C、180r/min摇床中培养。

1.2.3 漆酶活力测定 超净工作台中取待测样发酵液500μL，台式离心机中4000r/min离心5min，上清液即为粗酶液。酶活性测定体系为3mL，其中0.1mol/L，pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液2.7mL，适当稀释的粗酶液0.1mL和0.5mol/LABTS溶液0.2mL。25°C水浴锅中反应3min后，迅速转入冰水以终止反应。用紫外可见分光光度计测定420nm处反应吸光值的变化。定义1min氧化1μmolABTS所需的酶量为1个酶活力单位（U/L）。每个样品3个重复，以煮沸灭活粗酶液为对照。漆酶活性计算公式[10-11]如下：

[? OD×V1? t×V2×ε420]×106×稀释倍数

式中：ε420（ABTS）=3.6X104L/（mol·cm）;△t=1min;△OD为1min内吸光度的变化值;V1为酶反应中反应液的总体积，3mL;V2为酶反应中酶液的体积，0.1mL。

1.2.4 产漆酶菌株的筛选 将活化的菌株接种到以愈创木酚为底物的培养基上培养，定时观察菌落生长和菌落周围颜色深浅变化情况。选出颜色适中且没有明显抑制作用的显色圈的菌株。每天定时观察菌落形态的同时，测定变色圈的出现时间、测量变色圈直径和记录变色圈颜色深浅，通过上述方法比较得出不同菌种的产漆酶能力[12-13]。

1.2.5 单因素试验 （1）pH在基本培养基中加入适量的氢氧化钠溶液或盐酸溶液，将pH分别调试至3、5、6、7、9。温度为常温25°C，C/N为1∶5，每个水平做3次，取平均值。培养后测定并记录结果。（2）温度对菌种产漆酶的影响：改变恒温培养箱的温度设定，使其为20、25、28、30、35°C，pH调试至6，C/N为1∶5，每个水平做3次，取平均值。培养后测定并记录结果。（3）培养时间：设定培养时间为3、5、7、9、11d，pH调试至6，保持室温25°C，C/N为1∶5，每个水平做3次，取平均值。培养后测定并记录结果。（4）培养基中碳氮比：在基础培养基中保证温度为常温25°C，pH调试至6，碳源氮源总量不变的情况下，改变C/N（蔗糖/豆粕）比例（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1），每个水平做3次，取平均值。培养后测定并记录结果。

1.2.6 正交试验 根据1.2.4单因素试验研究中的实验结果，从每种单因素中各自选取3个水平进行L9（34）正交实验设计。选出最优的条件后，根据最优条件做3次重复试验，验证结果。

2 结果与分析

2.1 不同菌种的产漆酶能力 在常温条件下用1.2.4中的方法对4种菌种进行培养，首先选择无明显抑制作用和出现变色圈时间较短的培养基，然后在其中选择变色圈颜色适中、直径较大的菌种。进行1.2.5漆酶活力测定。结果见表1，由表1可知，在相同条件下，金针菇产漆酶活力最强，其余菌株较低，故选用金针菇作为后续实验的试验菌种。

2.2 pH对产漆酶能力的影响 由图1可见，随着pH的增大，金针菇菌种发酵产漆酶的酶活力先升高后降低。在pH=5时，漆酶活力最高（235U/mL）、漆酶的产量最多;pH继续增加可能会对金针菇的生长产生部分抑制作用，分泌的漆酶产量下降。由此可见，在培养的过程中，过高过低的pH既不利于发酵产漆酶，又不利于金针菇的生长。

2.3 温度对产漆酶能力的影响 由图2可见，随着温度的改变，针菇菌种发酵产漆酶的酶活力先升高后降低，但总体影响并不明显，28°C时出现峰值。生产漆酶时，可以考虑不用调整温度，保持室温即可，但不宜偏高或偏低，因为温度较高或较低都会抑制金针菇产漆酶的活力。

2.4 培养时间对菌种产漆酶的影响 由图3可见，随着时间的延长，金针菇菌种发酵产漆酶的酶活力先升高后降低，在时间为7d时活力最高（311U/ml）、漆酶的产量最多。若继续延长培养时间，漆酶会被降解导致酶活力降低，所以在培养过程中培养时间不宜过长。

2.5 培养基中碳氮比的不同对漆酶的影响 由图4可见，在碳源氮源总量不变的情况下随着碳源的增加，其菌种产漆酶的活力逐渐提高。在碳氮比为10∶1到20∶1范围内金针菇产漆酶活力最高。

2.6 正交实验结果及分析 根据单因素实验的结果，从这3种单因素中各自选取3个水平进行L9（34）正交实验设计（表2）。正交实验结果见表3，由表3可知，影响金针菇发酵产漆酶量多少的主要因素是培养基的碳氮比，其次是发酵时间，然后是发酵培养基的初始pH，最后是发酵温度。温度对发酵过程中产漆酶的影响比较小，所以在发酵过程中保持室温就可以。把控好发酵时间以免培养时间过长导致漆酶被降解，产漆酶量降低。

2.7 结果验证及分析 按照2.5中最优的实验方案，进行3次重复试验，测得漆酶活力的数值为330U/mL，相对标准偏差小于5%，但是实验数值高于正交数值，证明此培养基条件为最适培养条件。

3 结论与讨论

根据实验最终确定金针菇发酵高产漆酶的最优条件是碳氮比为10∶1，pH为6，发酵温度为28℃，培养时间为5d，在实际生产中需要改变的因素比较容易，改动范围较窄，因此有利于实施，故此方案可作為高产漆酶的方案。

（责编：张 丽）