胶孢炭疽菌黑色素合成途径中漆酶蛋白生物信息学分析

祝友朋 陈摇 韩长志

摘要：胶孢炭疽菌可以侵染桃、核桃等诸多重要农林植物，它可引起生产上诸多经济树种的炭疽病，严重威胁着各国农林业的健康生产。植物病原丝状真菌中黑色素合成途径中关键环节漆酶已经在稻瘟病菌、玉米大斑病菌等进行了较为深入的研究，然而尚未见有关胶孢炭疽菌黑色素合成途径中关键环节漆酶的生物信息学分析报道。本研究以胶孢炭疽菌中漆酶Cg14LAC氨基酸序列为基础，通过TargetP、SignalP、ProtComp、Phyre、big-PI Fungal Predictor、SMART、TMHMM等生物信息學分析工具对上述序列开展蛋白质亚细胞定位、细胞信号肽、二级结构、锚定位点、保守结构域、跨膜结构域等进行分析，同时对上述序列开展与炭疽菌属不同真菌遗传进化关系分析。研究结果为进一步深入开展该蛋白在致病过程中所具有的功能研究打下坚实的理论基础。

关键词：农林植物;胶孢炭疽菌;黑色素;漆酶;生物信息学;遗传进化

胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporiride）在分类上属于炭疽菌属真菌，作为引起多种农林业经济作物炭疽病的病原菌之一，可以危害芒果、柿树、草莓、桃树以及核桃等植物[1]。前人研究较多关注于该菌的形态特征、生活史以及遗传关系、致病基因等方面[2]。近些年，随着同属于炭疽菌属中的禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）、希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum）全基因组序列的公布[3]，笔者对上述病菌G蛋白信号通路相关蛋白进行生物信息分析，同时，也对该菌中重要的G蛋白信号通路调控因子RGS蛋白开展生物信息学分析[4]。

植物病原丝状真菌能否成功侵入寄主植物组织并在其中生长繁殖，是其能否成功导致植物发病的基本条件之一。DHN黑色素作为植物病原菌重要的毒力因子之一，其合成途径包括1个聚酮体合成酶基因、2个还原酶基因、2个脱水酶基因以及1个漆酶基因[5]。漆酶作为一种广泛存在于真菌、细菌、昆虫和植物中含铜的多酚氧化酶，能够催化酚类化合物及其衍生物，使之生成相应的苯醌和水[6]。目前，学术界关于漆酶在植物病原丝状真菌中的报道较多，如稻瘟病菌[7]、灰霉菌[8]、玉米大斑病菌[9]、番茄枯萎病菌[10]等。漆酶基因与真菌的生长发育、分生孢子形成、黑色素合成、致病性等相关，但在不同植物病原真菌中的作用差异很大。就炭疽菌属中真菌漆酶基因的研究而言，在西瓜炭疽病病菌（Colletotrichum orbiculare）中，漆酶基因1ac2调控附着胞黑色素和分生孢子色素沉着，突变后致病力丧失[11]。然而，漆酶基因lac1在黄瓜炭疽菌（Colletotrichum lagenarium）中并非是黑色素合成和对寄主致病力的必要因素[12]。芒果胶孢炭疽菌漆酶基因lac1不仅可以调控降解芒果组织中的酚类物质、促进病原菌的扩展，也可以通过干扰与致病力相关的黑色素合成和细胞壁降解酶的产生来影响其致病力[13];推测1ac2可能调控分生孢子萌发，也可能参与调控其漆酶活性和抗氧化反应等[14]。

目前，对于C. gloeosporioides黑色素合成途径中关键环节漆酶的生物信息学分析尚未见报道，近些年，随着云南省各地区大面积种植核桃[15]，各地区核桃炭疽病发生较为严重（韩长志等，未发表数据），因此，深入开展该菌黑色素合成相关基因的研究，可以更好地明确病原菌的致病机制[16]，对于进一步深入开展该蛋白在致病过程中所具有的功能具有非常重要的理论指导和生产实践意义。

1 材料与方法

1.1 材料

根据西瓜炭疽菌中已经报道的漆酶蛋白LAC1、LAC2序列（蛋白编号为BAB32575、BAN13563.1）[11]，在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，简称NCBI）数据库中进行BLASTp比对，获得胶孢炭疽菌 Cg-14以及Nara gc5菌株的LAC1、LAC2蛋白序列，分别命名为Cg14LAC1、Cg14LAC2、CgNLAC1、CgNLAC2。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质转运肽及信号肽预测 利用TargetP 1.1 Server[17]和SignalP 4.0 Server[18]分别实现对蛋白质转运肽的预测、信号肽的预测。

1.2.2 亚细胞定位及锚定位点分析 利用ProtComp v9.0和big-PI Fungal Predictor分别实现蛋白的定位[19]、锚定位点情况[20]。

1.2.3 蛋白质疏水性预测及理化性质分析 利用ExPASy[21]实现。

1.2.4 蛋白质保守结构域及跨膜结构域预测 利用SMART[22-23]实现对蛋白的保守结构域预测;利用TMHMM Server v.2.0[18]和HMMTOP version 2.0[24]、TMpred等跨膜网站对蛋白质的跨膜区结构进行预测。

1.2.5 二级结构预测 采用Phyre2在线分析实现[25]。

1.2.6 系统进化树构建 在NCBI中找寻Cg14LAC1、Cg14LAC2的同源序列，利用ClustalX[26]进行多重比对分析，随后利用MEGA 7.0软件[27]构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 序列分析

通过对胶孢炭疽菌中Cg14LAC1、Cg14LAC2、CgNLAC1、CgNLAC2序列进一步分析，结果表明，Cg14LAC1比CgNLAC1序列多43个氨基酸，位置为第334～376氨基酸，推测可能原因在于测序结果不准确或者自然原因丢失，尚不能确定，而Cg14LAC2与CgNLAC2序列相同。为了更好地开展胶孢炭疽菌中漆酶蛋白的生物信息学分析，因此，本研究选择Cg14LAC1、Cg14LAC2进行后续分析。

2.2 转运肽、信号肽以及亚细胞定位、锚定位点预测

通过对Cg14LAC1与Cg14LAC2的信号肽分析，上述蛋白均具有明显的信号肽序列，位置分别为第22、23位和第23、24位，最大切割率均为0.450，上述蛋白均属于分泌蛋白;进一步对其转运肽、亚细胞定位以及锚定位点进行分析，转运肽分析结果表明，上述蛋白均定位在线粒体上，但其预测可靠性概率不同（表1），同时，亚细胞定位分析结果表明，上述蛋白定位于胞外，可结合在膜上（表2）;尽管如此，通过对上述蛋白进行锚定位点的预测分析，并未发现上述蛋白含有锚定位点。

2.3 疏水性及理化性质分析预测

通过对Cg14LAC1与Cg14LAC2进行疏水性预测，明确Cg14LAC1中位于第132位的苏氨酸（T），其亲水性最强（-3.267），而位于第16位的亮氨酸（L），疏水性最强（2.044）;与Cg14LAC1不同，Cg14LAC2中位于第375位的谷氨酰胺（Q），亲水性最强（-2.889）;而位于第15位的亮氨酸（L），疏水性最强（2.489）（表3）。

一般而言，组成蛋白质的氨基酸种类可以分为酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性R基氨基酸以及不带电荷的极性R基氨基酸等4类。对Cg14LAC1与Cg14LAC2氨基酸组成进行分析，明确上述蛋白在氨基酸组成方面，无论是数量，还是在所占比例方面均没有太大的差别（表5）。

2.4 保守结构域及跨膜结构域分析

通过对Cg14LAC1与Cg14LAC2进行疏水性预测，明确上述蛋白均不含有保守的结构域;同时，利用HMMTOP以及TMHMM进行分析，上述蛋白均不具有跨膜区;进一步通过TMpred分析，发现Cg14LAC1具有2个跨膜区，Cg14LAC2具有1个跨膜区（表6），推测上述跨膜结构应为前期预测的信号肽更为准确。因此，胶孢炭疽菌中Cg14LAC1是否具有跨膜区域有待进一步通过生物学试验进行验证，而Cg14LAC2不具有跨膜区结构。

2.5 二级结构预测及组成情况分析

目前，预测蛋白质二级结构的常用方法除Phyre[28]和PSIPRED[29]外，还有PHD等方法。上述方法所得结果基本相似，本研究以Phyre所分析结果为例，明确胶孢炭疽菌中Cg14LAC1和Cg14LAC2蛋白含有α螺旋、无规则卷曲和β转角、TM螺旋等结构（图1），各结构所占比例大体相当。

2.6 遗传关系分析

以Cg14LAC1、Cg14LAC2为基础序列，通过BLASTp同源性搜索，獲得与胶孢炭疽菌漆酶具有同源性的炭疽菌属不同真菌的氨基酸序列，根据其同源关系数值，结合Cg14LAC1、Cg14LAC2序列，利用MEGA 7.0进行系统进化分析，明确胶孢炭疽菌Cg14PLC1与Cg14PLC2分别形成具有不同群体的2类（数据未显示），Cg14PLC1与胶孢炭疽菌中另外一个菌株Nara gc5中的CgNPLC1（XP_007283028.1）序列相同，与同属于炭疽菌属的其他真菌C. orbiculare中的ENH79795.1亲缘关系较近;Cg14PLC2则与胶孢炭疽菌中的AFK76451.1亲缘关系较近，并与菌株Nara gc5中的CgNPLC2（XP_007273654.1）聚为一类。

3 讨论

前期，利用NCBI蛋白数据库，对胶孢炭疽菌中漆酶蛋白进行“Colletotrichum gloeosporioides AND laccases”关键词搜索，结果表明有57个蛋白，对上述蛋白逐一查看，去除西瓜炭疽菌中的漆酶蛋白，剩余46个蛋白，对这些蛋白开展遗传关系分析，可以分为13个小类，该结果表明胶孢炭疽菌在不同炭疽菌属种中的漆酶蛋白并不具有较强的保守性，该结果为进一步解释胶孢炭疽菌可以侵染诸多农林植物提供新的研究思路。

同时，由于胶孢炭疽菌全基因组序列并未完全释放，本研究根据同属于炭疽菌属的西瓜炭疽菌中已经报道的LAC1、LAC2进行BLASTp比对，从而获得胶孢炭疽菌Cg-14、Nara gc5菌株中的LAC1、LAC2，并对其开展包括二级结构、疏水性、理化性质等全面的生物信息学分析预测工作，为进一步开展引起核桃炭疽病的炭疽病菌中漆酶的功能研究提供重要的理论参考。

胶孢炭疽菌是造成多种农林业上植物产生重要损失的病原菌之一[30-31]，它主要通过产生附着胞利用机械压力穿透植物侵入寄主。黑色素是否合成直接关系到病原菌附着胞能够形成巨大膨压从而侵入寄主组织，因此，开展该病菌菌黑色素合成相关基因的研究对于进一步解析病原菌致病机制具有重要的理论意义，同时，也为进一步开发适合于今后生产上适用的靶标杀菌剂具有重要的应用价值。

4 结论

本研究以胶孢炭疽菌中漆酶Cg14LAC氨基酸序列为基础，通过TargetP、SignalP、ProtComp、Phyre、big-PI Fungal Predictor、SMART、TMHMM等生物信息学分析工具对上述序列开展蛋白质亚细胞定位、细胞信号肽、二级结构、锚定位点、保守结构域、跨膜结构域等分析，同时，对上述序列开展了与炭疽菌属不同真菌遗传进化关系分析。

参考文献：

[1]韩长志. 胶孢炭疽病菌的研究进展[J]. 华北农学报，2012，27（增刊1）：386-389.

[2]韩长志. 胶孢炭疽菌侵染过程相关基因研究进展[J]. 广东农业科学，2014，41（9）：165-169.

[3]OConnell R J，Thon M R，Hacquard S，et al. Lifestyle transitions in plant pathogenic Colletotrichum fungi deciphered by genome and transcriptome analyses[J]. Nature Genetics，2012，44（9）：1060-1065.

[4]韩长志. 胶孢炭疽菌RGS蛋白生物信息学分析[J]. 河南师范大学学报（自然科学版），2015（1）：116-122.

[5]贾 慧，孟庆江，李志勇，等. 玉米大斑病菌黑色素合成酶基因的全基因组定位及表达模式分析[J]. 中国农业科学，2015，48（14）：2767-2776.

[6]Widsten P，Kandelbauer A. Laccase applications in the forest products industry：a review[J]. Enzyme and Microbial Technology，2008，42（4）：293-307.

[7]陈 新. 稻瘟病菌两个漆酶基因功能分析[D]. 福州：福建农林大学，2008.

[8]Sbaghi M，Jeandet P，Bessis R，et al. Degradation of stilbene‐type phytoalexins in relation to the pathogenicity of Botrytis cinerea to grapevines[J]. Plant Pathology，2010，45（1）：139-144.

[9]孟 川. 玉米大斑病菌StLAC2基因与黑色素合成及致病性关系研究[D]. 保定：河北农业大学，2013.

[10]Caero D C，Roncero M I. Functional analyses of laccase genes from Fusarium oxysporum[J]. Phytopathology，2008，98（5）：509-518.

[11]Lin S Y，Okuda S，Ikeda K，et al. LAC2 encoding a secreted laccase is involved in appressorial melanization and conidial pigmentation in Colletotrichum orbiculare[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2012，25（12）：1552-1561.

[12]Tsuji G，Fujikawa J，Ishida H，et al. Laccase gene LAC1 of colletotrichum lagenarium is not essential for melanin biosynthesis and pathogenicity[J]. Journal of General Plant Pathology，2001，67（3）：182-190.

[13]韋运谢，张 贺，刘晓妹，等. 芒果胶孢炭疽菌漆酶lac1与致病力的相关性分析[J]. 中国植保导刊，2016，36（11）：5-10.

[14]韦运谢，蒲金基，张 贺，等. 胶孢炭疽菌漆酶基因Lac2的序列特征与表达分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（9）：35-38.

[15]李 娅，韩长志. 云南省核桃产业发展现状及对策分析[J]. 经济林研究，2012，30（4）：162-167.

[16]曹志艳. 玉米大斑病菌黑色素合成途径相关基因的克隆及功能分析[D]. 保定：河北农业大学，2009.

[17]Emanuelsson O，Brunak S，von Heijne G，et al. Locating proteins in the cell using TargetP，SignalP and related tools[J]. Nature Protocols，2007，2（4）：953-971.

[18]Dyrlv-Bendtsen J，Nielsen H，von Heijne G，et al. Improved prediction of signal peptides：SignalP 3.0[J]. Journal of Molecular Biology，2004，340（4）：783-795.

[19]Emanuelsson O，Nielsen H，Brunak S，et al. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence[J]. Journal of Molecular Biology，2000，300（4）：1005-1016.

[20]Eisenhaber B，Schneider G，Wildpaner M，et al. A sensitive predictor for potential GPI lipid modification sites in fungal protein sequences and its application to genome-wide studies for Aspergillus nidulans，Candida albicans，Neurospora crassa，Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe[J]. Journal of Molecular Biology，2004，337（2）：243-253.

[21]Gasteiger E，Hoogland C，Gattiker A，et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[J]. The proteomics protocols handbook：Springer，2005：571-607.

[22]Schultz J，Milpetz F，Bork P，et al. SMART，a simple modular architecture research tool：identification of signaling domains[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95（11）：5857-5864.

[23]Letunic I，Doerks T，Bork P. SMART 7：recent updates to the protein domain annotation resource[J]. Nucleic Acids Research，2012，40：D302-D305.

[24]Tusnady G E，Simon I. The HMMTOP transmembrane topology prediction server[J]. Bioinformatics，2001，17（9）：849-850.

[25]Kelley L A，Mezulis S，Yates C M，et al. The phyre2 web portal for protein modeling，prediction and analysis[J]. Nature Protocols，2015，10（6）：845-858.

[26]Thompson J D，Gibson T J，Higgins D G . Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX.[J]. Curr Protoc Bioinformatics，2002，Chapter 2（Unit 2）：Unit 2.3.

[27]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[28]Kelley L A，Sternberg M J. Protein structure prediction on the Web：a case study using the Phyre server[J]. Nature Protocols，2009，4（3）：363-371.

[29]Buchan D W A，Minneci F，Nugent T C O，et al. Scalable web services for the PSIPRED Protein Analysis Workbench[J]. Nucleic Acids Research，2013，41（W1）：W349-W357.

[30]劉邮洲，陈夕军，尹小乐，等. 23株芽胞杆菌及其脂肽类化合物抑菌活性比较[J]. 江苏农业学报，2017，33（3）：533-542.

[31]柳志强，李乔曼，徐 爽，等. 催吐萝芙木内生菌Bacillus subtilis LYM3的抑菌活性产物[J]. 江苏农业学报，2017，33（1）：67-72. 张玉佩，陆建飞. 江苏省小麦生产的时序变化及比较优势分析[J]. 江苏农业科学，2019，47（6）：52-57.