高效氯氰菊酯暴露下草鱼器官碱性磷酸酶活性的变化

牛景彦 刘占才　王育水　张安世

摘要：研究了暴露在不同浓度高效氯氰菊酯下草鱼（Ctenopharyngodon idellas）鳃、肝胰脏和肾脏组织中碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）的活性变化。试验中高效氯氰菊酯浓度设5组（0、0.5、1.0、3.0和5.0 μg/L），每组分别于1、5和12 d时取样，测定鳃、肝胰脏和肾脏组织中AKP的活性。结果表明，0.5 μg/L高效氯氰菊酯暴露1 d时，鳃中AKP活性显著下降（P<0.05），肝胰脏和肾脏中的AKP活性无显著变化（P>0.05）；暴露5 d时，鳃和肾脏中AKP活性显著或极显著降低（P<0.05，P<0.01），肝胰脏中AKP活性无显著变化（P>0.05）；暴露12 d时，鳃和肾脏中AKP活性极显著下降（P<0.01），肝胰脏中AKP活性无显著变化（P>0.05）。1.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1 d，肝胰脏和肾脏中AKP活性无显著变化（P>0.05），鳃中AKP活性显著或极显著下降（P<0.05，P<0.01）；暴露5 d时，肾脏中AKP活性显著或极显著下降（P<0.05，P<0.01），肝胰脏中AKP活性无显著变化（P>0.05）；暴露12 d，鳃、肝胰脏和肾脏中AKP活性显著下降（P<0.01）。3.0 μg/L和5.0 μg/L高效氯氰菊酯显露1、5和12 d，所测定组织中AKP活性均显著或极显著下降（P<0.05，P<0.01）。

关键词：草鱼（Ctenopharyngodon idellas）；高效氯氰菊酯；碱性磷酸酶活性

中图分类号：Q956.86 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-2968-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.041

Changes of Alkaline Phosphatase Activity in Organs of Grass Carp Exposed to the Different Beta-cypermethrin Concentration

NIU Jing-yan，LIU Zhan-cai，WANG Yu-shui，ZHANG An-shi

（Department of Technology， Jiaozuo Teachers College， Jiaozuo 454001， Henan，China）

Abstract： To study dynamic changes of alkaline phosphatase activity（AKP） in gill， hepatopancreasand kidney of grass carp（Ctenopharyngodon idellas）exposed to the different Beta-cypermethrin concentration can be helpful to understand of Beta-cypermethrin effect on AKP. In this study，grass carps were randomly divided into five groups including control group and four different Beta-cypermethrin concentration groups （0.5、1.0、3.0 and 5.0 μg/L）.Each was in replication. Biochemistry methods were used to measure AKP activity of gill，hepatopancreas and kidney sampled on day 1，5 and 12，respectively. The results were as follows： contrast to the control，for 0.5 μg/L，AKP activity of gills was sharply reduced（P<0.05）， but that of hepatopancreas and kidneys didnt significantly change （P>0.05）on day 1，then AKP activity of gills and kidneys sharply reduced（P<0.01，P<0.05），but no significant change happened for that of hepatopancreas（P>0.05） on day 5. Finally that of gills and kidneys significantly decreased （P<0.01），and that of hepatopancreas returned to the normal level on day 12.For 1.0 μg/L，AKP activity of gills was sharply reduced（P<0.01，P<0.05），but that of hepatopancreas and kidneys didnt significantly change （P>0.05）on day 1，then AKP activity of serum significantly increased（P<0.01），that of spleens and kidneys were sharply reduced（P<0.01，P<0.05），but that of hepatopancreas didnt significantly change（P>0.05） on day 5. Finally AKP activity of serum didnt sharply change （P>0.05），that of gills，hepatopancreas，spleens and kidneys significantly decreased （P<0.01）on day 12. For 3.0 μg/L and 5.0 μg/L，AKP activity of serum，gills，hepatopancreas，spleens and kidneys significantly decreased（P<0.01，P<0.05）.

Key words： Ctenopharyngodon idellas；beta-cypermethrin；activity of alkaline phosphatase

高效氯氰菊酯是一种高效低毒的拟除虫菊酯类农药，因其对哺乳动物、鸟类的低毒性和对有害昆虫的高效杀灭性而被广泛的应用于农作物、园艺植物、家庭卫生害虫的防治[1]。在水产养殖方面也被作为有机磷农药的替代品用来防治寄生虫和控制有害水生昆虫的过度增殖[2，3]。由于过量使用，雨水冲刷使高效氯氰菊酯通过地表径流进入河道、湖泊等水体，导致非杀灭目标的水生无脊椎动物、鱼类等对神经毒素类农药非常敏感的生物受到影响[4，5]。研究表明，拟除虫菊酯对鱼类的毒性是哺乳动物和鸟类的1 000倍[6]。目前，关于高效氯氰菊酯对鱼类的影响方面的研究报道很多，主要集中于对鱼类的毒性研究方面[7，8]，对鱼类的代谢酶活性的影响方面也有一定量的报道[9，10]。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）在生物体内核酸、蛋白质和脂类等物质代谢中起着重要的作用，但鲜见高效氯氰菊酯对鱼类AKP活性影响方面的报道。高效氯氰菊酯在水体中的浓度通常低于鱼类的致死浓度，鱼类长期在该环境中生存，必然会对其生理代谢造成影响。草鱼（Ctenopharyngodon idellas）是我国重要的淡水养殖鱼类，对环境因子的变化较为敏感，本试验研究了低浓度高效氯氰菊酯对草鱼AKP活性的影响，对探索高效氯氰菊酯对鱼类毒性作用机理有着重要的理论意义，同时对评估鱼类产品的质量及指导水产养殖业的健康发展也有着积极的实践意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用草鱼为鱼种场同批、同池养殖的健康草鱼，体重（100±15） g，体长（15±3） cm。

1.2 适应性驯化

将草鱼随机分为5组，每组30尾，每组各两个平行，放入饲养箱中适应性驯养1周，期间定时投饵。养殖用水为充氧曝气的自来水，每箱放水100 L。光周期12L∶12D；养殖水温（19±2） ℃；每3 d换水1次，小型增氧机增氧，各组饲养管理方法相同。

1.3 高效氯氰菊酯暴露处理

采用常规急性毒性试验方法[11]，测定了高效氯氰菊酯对草鱼的96 h半致死浓度（LC50）为6.1 μg/L，设定高效氯氰菊酯浓度为0.5、1.0、3.0、5.0 μg/L 4个处理组（以市售0.4%的高效氯氰菊酯乳液配制）和1个对照组，每组2个平行，正常投喂。试验开始后，于1、5、12 d分别从各浓度组随机取10尾鱼，用于AKP活性的测定。

1.4 酶粗提液制备

解剖鱼体，取出鳃、肝胰脏和肾脏组织，按1∶19（m/V）加入0.9%生理盐水，冰浴匀浆后4 ℃下12 000 r/min离心10 min后取上清液，保存于-20 ℃。

1.5 粗提液蛋白定量

蛋白质定量参照Bradford[12]的方法，标准蛋白为牛血清白蛋白（BSA，购于BBI公司）。

1.6 酶活性测定

AKP活性测定采用陈清西等[13]的方法进行测定。AKP活性单位定义：28 ℃下每克粗蛋白15 min内催化对硝基苯磷酸二钠（pNPP，购于BBI公司）生成1 mg对硝基酚的酶量为1个酶活单位（U/g）。

1.7 数据处理

采用EXCEL2003统计分析软件进行One-way ANOVA分析和独立性t检验，显著性水平设为P<0.01或P<0.05。

2 结果与分析

2.1 高效氯氰菊酯暴露下草鱼鳃中AKP活性的变化

在不同浓度高效氯氰菊酯下暴露不同时间，对照组草鱼鳃暴露1、5、12 d时AKP活性无显著变化（P>0.05），各处理组在不同暴露时间，AKP活性均显著或极显著性下降（P<0.05，P<0.01），并表现出明显的时间、剂量效应（图1）。

2.2 高效氯氰菊酯暴露下草鱼肝胰脏中AKP活性的变化

对照组暴露1、5、12 d时酶活性之间无显著变化（P>0.05）。0.5 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5和12 d时，酶活性无显著变化（P>0.05）；1.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5 d对酶活性无显著影响（P>0.05），12 d时酶活性显著下降（P<0.05）；3.0 μg/L和5.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5和12 d时，酶活性均显著或极显著下降（P<0.05，P<0.01）（图2）。

2.3 高效氯氰菊酯暴露下草鱼肾脏中AKP活性的变化

对照组暴露1、5、12 d 时，肾脏中AKP酶活性之间无显著变化（P>0.05）。0.5 μg/L和1.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1 d，酶活性无显著变化（P>0.05），暴露5、12 d，酶活性显著或极显著下降（P<0.05，P<0.01）；3.0 μg/L和5.0 μg/L高效氯氰菊酯暴露1、5和12 d，酶活性均极显著下降（P<0.01） （图3）。

3 小结与讨论

AKP是动物代谢过程中重要的调控酶，是一种非特异性的磷酸单酯酶，主要参与生物体对物质的消化、吸收、转运，调节动物体内钙、磷吸收，在维持钙、磷平衡方面起着重要作用，是鱼类赖以生长、生存的重要酶类之一[12]。在物质交换、吸收转运旺盛的器官中，AKP均呈现出高活性。

Clark等[14]研究认为菊酯类杀虫剂对鱼类毒性极大，是由于鱼类的鳃组织极易从外界吸收此类物质。本试验中，短时间（1 d）低浓度（0.5 μg/L）暴露下，草鱼鳃中AKP活性显著下降的结果印证了这一观点。王朝晖等[15]研究发现，菊酯类杀虫剂对鳃组织能够造成病理性损伤，破坏鳃组织的离子代谢和渗透平衡，从而影响鱼鳃的生理代谢，本试验各处理组AKP活性均显著低于对照的结果也佐证了这一论点。

有研究[16-18]发现，鱼体处于氯氰菊酯环境胁迫初期，体内产生过量的氧自由基，诱导SOD活性提高使二者达到一种新的平衡；但随着氯氰菊酯作用时间的延长，鱼体会产生大量的氧自由基，而SOD酶活性被抑制，导致肝组织损伤。本试验中草鱼肝胰脏中AKP活性的变化表明，在低浓度（0.5、1.0 μg/L）、短时间（1、5 d）暴露下，肝胰脏对高效氯氰菊酯有一定的耐受性；但随着高效氯氰菊酯浓度的增加（3.0、5.0 μg/L）和暴露时间（12 d）的延长，活性受到显著或极显著抑制，这可能与鱼类肝胰脏中缺少可分解高效氯氰菊酯的酶有关，当高效氯氰菊酯的胁迫作用超出了肝胰脏的耐受能力后，其代谢功能受到明显的影响。

有报道发现，氯氰菊酯能够通过抑制鱼类细胞质膜ATP酶的活性，使质膜主动转运受到破坏，进而影响质膜的离子转运和离子平衡，导致质膜逆浓度梯度转运离子产生障碍[19]。肾脏作为鱼体调节电解质平衡的主要器官，在氯氰菊酯的胁迫下，其保钠排钾功能减弱，导致鱼体内电解质平衡失调，进而影响肾脏的生理功能。本研究中氯氰菊酯对肾脏中AKP活性具有显著抑制作用，并表现出明显的剂量时间效应，也佐证了这一点。

本研究发现，草鱼鳃、肝胰脏和肾脏中AKP对高效氯氰菊酯的敏感性是不同的，这可能与它们不同的生理功能有关；高效氯氰菊酯的胁迫可以显著影响鳃、肝胰脏和肾脏的生理代谢，表明高效氯氰菊酯对草鱼具有较强的毒性。

参考文献：

[1] 胡志强，许良忠，任雪景，等.拟除虫菊酯类杀虫剂的研究进展[J].青岛化工学院学报，2002，23（1）：48-51.

[2] WENDT-RASCH L，PIRZADEH P， WOIN P. Effects of metsulfuron methyl and cypermithrin exposure on freshwater model ecosystems[J].Aquat Tocxicol， 2003，63（3）：243-256.

[3] DAS B K， MUKHERJEE S C. Toxicity of cypermethrin in Labeo rohita fingerlings： Biochemical， enzymatic and haematological consequences[J]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Phamacol， 2003，134（1）： 109-121.

[4] MIAN L S，MULLA M S.Effects of pyrethroid insecticides on nontarget invertebrates in aquatic ecosystems[J]. J Agric Entomol 1992， 9： 73-98.

[5] PHILIP G H， REDDY P M， SRRIDEVI G. Cypermethrin induced in vivo alterations in the carbohydrate metabolism of freshwater fish，Labeo rohita[J] Ecotoxicol Environ Saf，1995，31： 173-178.

[6] EELLS J T， RASMUSSEN J L， BANDETTINI P A， et al. Differences in the neuroexcitatory actions of pyrethroid insecticides and sodium channel-specific neurotoxins in rat and trout brain synaptosomes[J]. Toxicol Appl Pharmacol， 1993，123：107-119.

[7] USMANI K， KNOWLES C. Toxicity of pyrethroids and effect of synergists to larval and adult Helicoverpa zea， Spodoptera frugiperda，and Agrotis ipsilon（Lepidoptera： Noctuidae）[J]. J Econ Entomol，2001，94： 868-873.

[8] 王明学，扶 庆，周志刚，等.溴氰菊酯对草鱼早期发育阶段的毒性效应[J].水利渔业，2000，20（6）：39-40.

[9] 周志刚，王明学，吕敢堂，等.溴氰菊酯对草鱼鱼种脑AchE及ATP酶活性的影响[J].华中农业大学学报，1999，18（2）：176-179.

[10] KAMALAVENE K， GOPAL V， SAMPSON U，et al. Effect of pyrethroids on carbohydrate metabolic pathways in common carp，Cyprinus carpio[J]. Pest Manag Sci，2001，57：1151-1154.

[11] 孟紫强.环境毒理学基础[M].北京：高等教育出版社，2000.361-363.

[12] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein-dye binding[J].Anal biochem，1976，72：248-254.

[13] 陈清西， 颜思旭.文昌鱼碱性磷酸酶的必需基因研究[J].厦门大学学报（自然科学版），1986，25（5）：568-573.

[14] CLARK J R， JAMES M， PATRICK J，et al. Relative sensitivity of six estuarine fishes to carbophenothi on chloropyrifos and fenvalerate[J]. Ecotoxicol Environ Saf，1985，10：382-390.

[15] 王朝晖，尹伊伟，许忠能，等.8种拟除虫菊酯农药对稀有鮈鲫的急性、亚急性毒性研究[J].应用与环境生物学报，1998，4（4）：379-382.

[16] ROBERTS M H， SEVED D W， FELTON S P. Temporal changes in feral AHH and sod activity in feral spot from the Elizabeth river a polluted sub-estuary[J]. Mar Environ Res， 1987，23：89-101.

[17] 徐立红，张甬元，陈宜瑜.分子毒理学的研究进展及其在水环境保护中的意度[J].水生生物学报，1995，19（2）：171-185.

[18] 谢文平，马广智.氯氰菊酯对草鱼鳃和肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响[J].水产科学，2003，22（6）：5-7.

[19] 许阳光，李学锋，张文吉，等.低浓度醚菊酯对鲤鱼生长及生理生化指标影响的研究[J].河北大学学报，2005，28（1）：69-73.