超高效液相色谱—电喷雾串联质谱法检测茶叶中洛伐他汀的含量

吴晓刚 刘彬球 陈孝权 张偎 胡成芸 凌登猛

摘要：采用超高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱仪（UPLC-ESI-MS/MS），于多反应监测（MRM）模式下建立了茶叶中洛伐他汀的定性定量分析方法。样品经甲醇超声提取，Waters Acquity UPLC？誖BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）柱分离，超高效液相色谱-串联质谱法测定。在0.000 8～0.200 0 μg/mL间有良好的线性关系（R2>0.999 0），检出限为0.000 2 μg/mL；在3个添加浓度水平下，平均加标回收率为98.54%～ 109.86%；相对标准偏差（RSD，n=6）为1.45%～3.09%。该方法准确、可靠、灵敏度高，适用于茶叶中洛伐他汀含量的检测。

关键词：茶；超高效液相色谱-电喷雾串联质谱；洛伐他汀；多反应监测

中图分类号：O657.63 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2732-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.045

Determination of Lovastatin in Tea Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry

WU Xiao-gang， LIU Bin-qiu， CHEN Xiao-quan， ZHANG Wei， HU Cheng-yun， LING Deng-meng

（Technology Center Laboratory of Menghai Tea Industry Co.， Ltd， TAETEA Group， Menghai 666200， Yunnan， China）

Abstract： An UPLC-ESI-MS/MS method with multiple reaction monitoring （MRM） mode was developed for the qualitative and quantitative analysis of lovastatin in tea. The sample preparation was based on ultrasonic-assisted extraction，Waters Acquity UPLC？誖BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm） column separation and UPLC-MS/MS determination. The method showed a good linearity （R2>0.999 0） in the 0.000 8～0.200 0 μg/mL and LOD of 0.000 2 μg/mL. For three spiked levels，the average recoveries were from 98.54% to 109.86%， and the relative standard deviations （RSD，n=6） were from 1.45% to 3.09%. The method was reliable， accurate， sensitive and appropriate for the determination of lovastatin in tea.

Key words： tea； UPLC-ESI-MS/MS； lovastatin； multiple reaction monitoring （MRM）

1979年， Endo等[1]从Monascus ruber的培养液中分离出抑制HMG-CoA（3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A）还原酶活性的Monacolin K，同时 Alberts等[2]于1980 年也从Aspergillus terreus中分离出与Monacolin K相同的物质Mevinolin，后命名为洛伐他汀（Lovastatin），由Merk公司率先制成药品上市。洛伐他汀是人体胆固醇合成中的关键酶HMG-CoA还原酶的抑制剂，因其疗效好、副作用低，目前已被广泛地应用于临床高血脂症等疾病的治疗。

普洱茶是以云南大叶茶[Camellia sinensis （Linn.） var. assamica （Masters） Kitamura]的晒青毛茶为原料，在微生物的作用下，经漫长的自然陈化或快速人工渥堆后发酵而成。目前，能产洛伐他汀的微生物已见报道[3]，如曲霉菌（Aspergillus）、红曲霉菌（Monascus）、毛霉菌（Mucor）和青霉菌（Penicillium）等。Hwang等[4]首先在普洱茶中发现有洛伐他汀的存在；随后，Yang等[5]研究指出洛伐他汀是在普洱茶中发现的惟一的他汀类化合物，在乙酸乙酯提取物中含量较高，且全部以内酯环结构存在，而在100 ℃普洱茶水提取物中含量较低，以内酯环结构和羟酸结构两种形式存在；谢春生等[6]在普洱熟茶中也检测出了洛伐他汀，洛伐他汀含量与普洱茶发酵程度成正比，其提取工艺和产品（制剂）也申请了国家发明专利。

国内对洛伐他汀的测定始于20世纪90年代，最常见也是最典型的方法是高效液相色谱法，此外还有薄层扫描法和紫外分光光度法等。薄层层析法受试验条件干扰较大，方法的回收率较低；用紫外分光光度法对待测物检测专属性不强，准确度也不高；高效液相色谱法检测时间较长，检测效率低下。茶叶基质的复杂性增加了洛伐他汀含量检测的难度，近年来发展起来的超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）技术具有检测灵敏度高、适用范围广、分析速度快以及可有效排除复杂基质干扰等优点，因而成为首选的检测手段。但目前国内尚未见利用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）检测茶叶中洛伐他汀含量的文献报道。因此，本工作通过对茶叶中洛伐他汀物质的提取、净化及色谱-质谱检测条件进行研究，建立了UPLC-ESI-MS/MS测定茶叶中洛伐他汀含量的方法。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；甲酸（色谱纯，美国Tedia公司）；去离子水（昆明娃哈哈启力饮料有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；洛伐他汀标准品（纯度>98%，上海融禾医药科技有限公司）。

1.2 主要仪器

ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司）；WATERS XEVO TQD串联四级杆质谱仪（沃特世科技有限公司）；高效粉碎机（上海嘉定粮油仪器有限公司）；台式超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；超纯水系统（成都康宁实验专用纯水设备厂）；漩涡混合器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.3 检测方法

1.3.1 标准工作溶液配制及标准曲线 准确称取洛伐他汀标准品10 μg，用甲醇配制浓度依次为0.000 8、0.001 6、0.003 2、0.006 4、0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 μg/mL的洛伐他汀标准工作溶液，以进样质量浓度为横坐标（x）、响应的峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线。

1.3.2 检测条件 UPLC条件：Waters Acquity UPLC？誖BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；色谱柱温度40 ℃，进样室温度为20 ℃；进样量4 μL；流速0.3 mL/min；流动相A为去离子水（含体积分数为0.1%的甲酸），流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0.0～0.5 min，95%～30% A；0.5～3.0 min，30%～10% A；3.0～3.1 min，10%～95% A；3.1～6.0 min，95% A。

MS/MS条件：ESI+离子化模式；毛细管电压为2.50 kV；离子源温度为150 ℃；雾化气和脱溶剂气均为氮气，碰撞气为氩气；脱溶剂气温度为400 ℃，流速为800 L/Hr；多反应监测（MRM）模式。洛伐他汀离子对、锥孔电压、碰撞能量及保留时间见表1。

1.3.3 样品前处理 取普洱茶样品，四分法缩分后取200 g，粉碎后过1 mm孔径筛，混匀，备用。称取磨碎试样1 g（精确至0.001 g）于10 mL离心管中，加入5 mL甲醇，超声提取20 min，期间每5 min振摇一次，离心后将上清液移入10 mL容量瓶内；剩余茶渣继续加入5 mL甲醇，重复提取一次；合并两次上清液，定容刻度至10 mL。取1 mL，经0.22 μm微孔滤膜后，供UPLC-MS/MS测定。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

文献[7-9]利用C18色谱柱分离洛伐他汀均有较全面报道。Wang等[10]曾利用AcquityTM UPLC BEH C18柱对人体血浆中的洛伐他汀含量进行快速测定；Elzbieta等[11]采用Symmetry C18药物中降低胆固醇水平的洛伐他汀含量进行检测。故本试验选用Waters Acquity UPLC？誖BEH C18柱（1.7 μm， 2.1 mm×50 mm），其采用1.7 μm小颗粒填料在更宽线速度范围内可获得最佳的柱效，能显著提升色谱柱的性能。洛伐他汀标准溶液离子色谱图见图1。

2.2 流动相的选择

在液质联用技术的应用中，流动相的选择除考虑色谱柱的分离效果外，还必须考虑待测物质进入质谱前的离子化效率，以便获得最佳的分离度和最高的灵敏度。A流动相的甲酸可提供H+，维持目标离子质子化状态，增强洛伐他汀在流动相中的离子化程度，有助于提高检测灵敏度。B流动相中的乙腈黏度低，样品出峰峰形好，响应值也高[12]。故本试验选用0.1%甲酸水和纯乙腈作流动相。

2.3 方法的线性范围、检出限及定量限

在最佳试验条件下，本研究选取定量下限以上的不同浓度标准工作溶液进行液质联用分析，分别获得各自的峰面积，通过建立样品浓度与峰面积的标准曲线，得到线性方程为y=92 178.3x+162.3（R2=0.999 7）；以3倍信噪比计算检出限（LOD），10倍信噪比计算定量限（LOQ）分别为0.000 2和0.000 7 μg/mL。

2.4 稳定性考察

取0.1 μg/mL洛伐他汀标准工作溶液，于4 ℃下样品管理器中保存，分别在0、4、8、12、16、20、24 h取样进行日内精密度的测定。结果显示，日内相对标准偏差（RSD，n=7）为1.2%～3.4%。表明该方法具有较好的日内稳定性。

2.5 方法的回收率和精密度结果

准确称取1 g制备好的茶叶样品于10 mL离心管中，分别添加如表3所示浓度水平的混合标准溶液，涡旋3 min，静置30 min。每个添加水平设6次重复，按照“1.3.3”方法进行样品前处理后进样检测。由表2可见，在3个添加浓度水平下，均满足回收率和精密度要求。

3 小结与讨论

本研究通过用超声法提取茶样中的洛伐他汀，优化超高效液相色谱-串联质谱条件，建立了用液质法快速测定洛伐他汀含量的检测方法，并对该方法进行了验证。试验结果表明，所建立的液-质法简单、灵敏、快速、准确，适用于普洱茶中保健物质洛伐他汀含量的测定。

参考文献：

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