红曲霉洛伐他汀的液态发酵及其分离纯化研究

陈景智，王力超，李亮，叶秀云，林娟

(福州大学，福建省海洋酶工程重点实验室，福建 福州，350116)

红曲，在我国已有1000多年历史，是古代食疗两用的中药材[1]，红曲中含有多种功能性成分，如红曲色素、氨基丁酸、洛伐他汀、麦角甾醇等[2]，还含有淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、酯化酶等多种酶类物质[3-5]，具有很好的研究意义。

洛伐他汀为日本学者远藤章于1979年从红色红曲霉菌(Monascusrubber)的发酵液中分离出来，发现其具有强烈抑制胆固醇合成的作用，命名为Monacolin K[6]。之后，远藤章又相继分离出Monacolin J、Monacolin L[7]、Monacolin X[8]和Monacolin M[9]，将这些物质统称为Monacolins，但Monacolin K还是主要作用物质。

随着人们生活水平的日益提高，患有心血管疾病的人越来越多，洛伐他汀作为治疗心血管疾病的理想药剂[10-11]，需求量日益增大，但生产过程中的产量低、周期长、成本高等问题限制了红曲洛伐他汀的实际应用。因此，本文对实验室选育得到的高产洛伐他汀红曲霉突变株R”-30进行液态发酵和分离纯化工艺研究，为工业化生产和应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种与试剂

红曲霉突变株R”-30(MonascusR”-30)，由福建省海洋酶工程重点实验室利用基因组重排技术选育得到。

蛋白胨购于Oxiod公司；柱层析用硅胶：80～120目，购自青岛海洋化工有限公司； Sephadex LH20，购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；酵母膏、甘油、葡萄糖、乙酸乙酯、MgSO4·7H2O、NaNO3、ZnSO4·7H2O、KH2PO4等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；SW-CJ-2F洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；HWS24电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；SHP-250生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；ZWYR-2102C恒温振荡培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司)；CF16RXⅡ高速冷冻离心机，日本HITACHI公司； D-2000 Elite型高压液相色谱仪，日本HITACHI。

1.1.3 培养基

PDA培养基：配制方法参照文献[12]。

种子培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨20，酵母膏20，黄豆粉10，甘油(分析纯)50，MgSO4·7H2O 1，NaNO32，ZnSO4·7H2O 2，KH2PO41。

液体发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，甘油(分析纯)50，蛋白胨10，酵母膏10，NaNO32，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 2，KH2PO41。

无碳源发酵培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏10，MgSO4·7H2O 1，NaNO32，ZnSO4·7H2O 2，KH2PO41。

无氮源发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，甘油50，MgSO4·7H2O 1，ZnSO4·7H2O 2，KH2PO41。

缺无机盐发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，甘油50，蛋白胨10，酵母膏10，NaNO32。

1.2 实验方法

1.2.1 洛伐他汀测定方法

1.2.1.1 紫外分光光度法

洛伐他汀在229、237和246 nm处有最大紫外吸收，其中以237 nm处吸光值最大，可通过测量OD237来初步判定洛伐他汀含量的高低[13]。取1 mL发酵液，加入9 mL乙醇(70%)振荡混匀，55 ℃，130 r/min 振荡提取1 h；4 200 r/min离心5 min，取上清，适当稀释后测量OD237。

1.2.1.2 高效液相色谱法(HPLC)

(1)HPLC检测条件[14]

色谱柱：HITACHI LaChromUltra C18(5 μm)；流动相：乙腈∶0.01%磷酸=60∶40；检测波长：238 nm；进样体积：10 μL；流速：1 mL/min；柱温：28 ℃。

(2)洛伐他汀(内酯型)标准曲线的绘制

准确称取洛伐他汀内酯型标准品5 mg，用甲醇定容至25 mL，得到200 mg/L的母液，系列稀释得到5，10，50，100，150 mg/L的样品。以洛伐他汀浓度为横坐标，以峰面积值为纵坐标绘制洛伐他汀浓度-峰面积标准曲线，每组实验重复3次。

由图1可知，当洛伐他汀浓度在0～200 mg/L时，线性关系良好，R2=0.998 4，回归方程为y=16 689x-1 202.6，内酯型洛伐他汀标准品的液相色谱图如图2所示。

图1 洛伐他汀(内酯型)浓度与峰面积关系曲线Fig.1 Curve of lovastatin(lactone form) concentration and peak area

图2 洛伐他汀(内酯型)标准品的液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of standard substance concentration and peak area of lovastatin(lactone form)

(3)洛伐他汀开环酸型溶液制备方法

准确称取洛伐他汀内酯型标准品5 mg，加4 mL甲醇溶解，加20 mL 0.2 mol/L NaOH溶液混匀后采用超声波处理30 min，取出冷却，用3 mol/L H3PO4调pH至6左右，加甲醇定容至25 mL，然后进行液相色谱检测，若洛伐他汀内酯型标准品全部转化为开环酸型，则洛伐他汀开环酸型浓度约为200 mg/L。

(4)洛伐他汀(开环酸型)标准曲线的绘制

方法同内酯型标准曲线的绘制。由图3可知洛伐他汀浓度在0～200 mg/L时，线性关系良好，R2=0.995 32，回归方程：y=20 339x+21 205。开环酸型洛伐他汀标准品的液相色谱图，如图4所示。

图3 洛伐他汀(开环酸型)浓度与峰面积关系曲线Fig.3 Curve of lovastatin(acid form) concentration and peak area

图4 洛伐他汀(开环酸型)标准品的液相色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of standard concentration and peak area substance of lovastatin (acid form)

(5)发酵液中洛伐他汀的检测

取1 mL发酵液，加入70%乙醇9 mL振荡混匀， 55 ℃，130 r/min振荡提取1 h，4 200 r/min离心5 min，取上清液用0.22 μm的有机微孔滤膜过滤，取滤液采用HPLC检测洛伐他汀含量，如方程(1)所示。

ρ(内酯型洛伐他汀)/mg·L-1)=(y+1 202.6)/16 689×稀释倍数

(1)

式中：y—内酯型洛伐他汀峰面积。

ρ(开环酸型洛伐他汀)/(mg·L-1)=(y-21 205)/20 339×稀释倍数

(2)

式中：y—酸型洛伐他汀峰面积。

1.2.2 红曲霉发酵培养基的优化

(1)碳源对洛伐他汀产量的影响：分别选取葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油、半乳糖、麦芽糖6种碳源添加到缺碳发酵培养基中(添加量均为2%表示100 mL 发酵液添加2 g碳源)，考察不同碳源对洛伐他汀产量的影响；确定最适碳源后，进一步研究不同添加量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)的影响。

(2)氮源对产洛伐他汀的影响：分别取有机氮源—蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米浆、黄豆粉等(添加量1%)；无机氮源—NaNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4(添加量0.2%)添加到缺氮培养基中，考察不同氮源对洛伐他汀产量的影响。确定最佳氮源后，进一步研究不同添加量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)的影响。

(3)无机盐对产洛伐他汀的影响：选择KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4(添加量0.1%)添加到缺无机盐培养基中，考察不同无机盐对洛伐他汀产量的影响。确定最佳无机盐后，进一步研究不同添加量(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)的影响。

(4)碳源、氮源、无机盐配比的正交试验：在上述实验基础上，对碳源、氮源、无机盐进行正交试验研究各自适宜的添加量。利用L9(34)正交表进行实验设计确定这些因素的最优配比。因素水平编码如表1所示。

表1 正交实验设计因素水平编码表 单位：%Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.2.3 红曲霉发酵条件的优化

(1)培养基初始pH的影响：调节发酵培养基pH分别为4、5、6、7、8，研究不同初始pH对菌株产洛伐他汀的影响，确定最适初始pH。

(2)种龄的影响：分别将不同菌龄(48、56、64、72、80 h)的种子液接种到发酵液中培养，确定最佳菌龄。

(3)接种量的影响：分别控制接种量为4%、8%、12%、16%、20%，研究最适接种量。

(4)发酵温度的影响：将摇瓶分别置于25、30、35 ℃和变温(28 ℃，2 d；26 ℃，2 d；25 ℃，2 d；23 ℃，数天)的摇床中进行发酵培养，确定适宜的发酵温度。

(5)摇床转速的影响：将摇瓶分别置于转速为100、150、200、230 r/min的摇床中进行发酵培养，确定适宜的转速。

(6)摇瓶装液量的影响：在250 mL锥形瓶中分别装25、50、75、100、125 mL发酵培养基，研究不同装液量对洛伐他汀产量的影响。

1.2.4 洛伐他汀的分离纯化

1.2.4.1 红曲中洛伐他汀提取分离路线

液态发酵液→洛伐他汀提取→离心→上清液浓缩→硅胶柱层析→洛伐他汀粗品→浓缩→LH20柱层析→收集→检测纯度[15-17]。

1.2.4.2 洛伐他汀提取

调节发酵液pH至碱性，于30 ℃、180 r/min的水浴摇床中提取1 h后，4 200 r/min离心5 min，取上清液。

2 结果与分析

2.1 红曲霉液态发酵产物中洛伐他汀类型的判定

采用HPLC检测发酵液中的洛伐他汀，色谱图见图5。

图5 发酵液中洛伐他汀的HPLC检测色谱图Fig.5 HPLC detection chromatogram of fermentation broth for the content of lovastatin

由图5可知，红曲霉液态发酵所产的洛伐他汀主要为开环酸型。据文献报道，天然红曲产的洛伐他汀多为酸型，其药效约为内酯型的2倍[18]，因此红曲霉洛伐他汀具有很好的药用功效。

2.2 洛伐他汀液态发酵工艺研究

2.2.1 发酵培养基优化

2.2.1.1 碳源对洛伐他汀产量的影响

不同碳源对洛伐他汀产量的影响如图6所示，碳源为甘油时洛伐他汀产量最高(定义为100%)，确定最佳碳源为甘油。进一步研究其不同添加量甘油对洛伐他汀产量的影响，从图7可以看出，在3%时达到最大值(定义为100%)。

图6 碳源对洛伐他汀产量的影响Fig.6 Effect of carbon sources on lovastatin yield

图7 甘油添加量对洛伐他汀产量的影响Fig.7 Effect of glycerol content on lovastatin yield

2.2.1.2 氮源对洛伐他汀产量的影响

不同氮源对洛伐他汀产量的影响如图8所示，黄豆粉效果最好(定义为100%)，确定为最佳氮源。进一步对黄豆粉的最佳添加量进行研究，实验结果见图9，添加量为2.5%时，洛伐他汀产量达到最大(定义为100%)，所以确定黄豆粉的最适添加量为2.5%。

图8 氮源对洛伐他汀产量的影响Fig.8 Effect of nitrogen sources on lovastatin yield

图9 黄豆粉添加量对洛伐他汀产量的影响Fig.9 Effect of soybean powder content on lovastatin yield

2.2.1.3 无机盐对洛伐他汀产量的影响

无机盐对洛伐他汀产量的影响如图10所示，其中ZnSO4·7H2O最高(定义为100%)，ZnSO4·7H2O和KH2PO4的洛伐他汀产量比较接近，所以选择KH2PO4和ZnSO4·7H2O两种无机盐进行后续实验。在后续实验中，无机盐添加量为两种无机盐添加量的总和，其中ZnSO4·7H2O和KH2PO4的添加量按照2∶1的配比来添加。不同无机盐添加量时洛伐他汀产量如图11所示，当添加量为0.05%时，洛伐他汀产量达到最高(定义为100%)，可推测少量的无机盐可对洛伐他汀的产量造成显著影响，量太多反而抑制洛伐他汀的合成。确定最佳无机盐添加量为0.05%。

图10 无机盐对洛伐他汀产量的影响Fig.10 Effect of inorganic salts on lovastatin yield

图11 无机盐添加量对洛伐他汀产量的影响Fig.11 Effect of inorganic salt content on lovastatin yield

2.2.1.4 碳源、氮源、无机盐最佳配比的正交试验

选择甘油、黄豆粉、KH2PO4和ZnSO4·7H2O四个 因素进行L9(34)正交试验，实验结果见表2。

表2 L9(34)正交试验结果Table 2 Results of L9(34) orthogonal expertments

根据上表极差R可知，影响洛伐他汀产量的因素主次顺序为B>C>A>D，最优组合为B1C3A2D2，即甘油3%、黄豆粉2%、ZnSO4·7H2O 0.47%、KH2PO40.017%。

验证实验在最优组合中A、D因素添加量不变的基础上，降低因素B两个水平，升高因素C两个水平，得到4个实验组，再取最优组合B1C3A2D2和正交试验中产量最高的第7组(见表2)为参考组，组成6组组合进行验证实验。验证实验结果见表3。

表3 验证实验结果分析表 单位：%Table 3 Analysis of test results

实验组3的洛伐他汀产量最高，但因硫酸镁对洛伐他汀合成也有一定的促进作用(见图10)，故在实验组3的基础上添加不同量的硫酸镁，进一步研究其对洛伐他汀产量的影响。结果见图12。

图12 硫酸镁添加量对洛伐他汀产量的影响Fig.12 Effect of MgSO4·7H2O content on lovastatin yield

由图12可知，当MgSO4·7H2O添加量为0.15%时，洛伐他汀产量最高(定义为100%)，所以确定红曲霉R”-30液态发酵最佳培养基配方为：甘油3%，黄豆粉1.5%，ZnSO4·7H2O 0.66%，KH2PO40.017%，MgSO4·7H2O 0.15%。

2.2.2 液态发酵条件优化

本实验对几个主要发酵条件进行了研究。实验结果(图13)表明，发酵液最佳初始pH为5，最适接种龄为64 h，最佳接种量为8%；恒温培养的效果优于变温培养，且发现30～35 ℃洛伐他汀产量相对较高，故选择30 ℃恒温培养的方式取代变温培养；最适转速为150 r/min，最佳装液量为50 mL/250 mL。

a-培养基初始pH值的影响; b-菌龄的影响; c-接种量的影响;d-温度的影响，V-T:变温; e-摇床转速的影响; f-装液量的影响图13 摇瓶发酵条件的优化Fig.13 Optimization of fermentation conditions in shake flask

2.3 红曲菌株R”-30液态发酵洛伐他汀产量测定

将菌株R”-30接种于优化后的发酵培养基中，在优化条件下培养，从第4天开始，每隔24 h取样测定发酵液中洛伐他汀产量，绘制洛伐他汀产量随发酵周期的变化曲线(图14)。

图14 菌株R”-30洛伐他汀产量与发酵周期的关系曲线Fig.14 The relationship curve of R”-30 lovastatin production and fermentation period

洛伐他汀产量于第10天开始趋于平稳，第12天达到最大值，此时洛伐他汀产量达到615.3 mg/L；与优化前相比，洛伐他汀产量由312 mg/L提高到615.3 mg/L，提高了97.2%。发酵周期没有改变，还是于第12天达到最大值。

2.4 发酵液中洛伐他汀的分离纯化

2.4.1 洛伐他汀提取工艺优化

洛伐他汀在发酵液中以洛伐他汀羧酸的形式存在，主要存在于菌丝体内。以NaOH(6 mol/L)调节发酵液的pH至碱性，将洛伐他汀转化为洛伐他汀酸钠并溶于发酵液中[19]。测定不同pH(9～12.5)对洛伐他汀溶出率的影响，以加70%乙醇，料液比1∶9，55 ℃，130 r/min萃取1 h的溶出率作对照，结果如图15所示。

图15 不同pH下洛伐他汀的溶出率Fig.15 The dissolved quantity of lovastatin at different pH

当调发酵液pH为11时，洛伐他汀的溶出率相对较高，而pH超过12.5时，溶出率急剧下降，可能是强碱条件破坏了洛伐他汀的结构，从而检测不出。故确定pH 11为最佳溶出pH。

2.4.2 硅胶柱洗脱

取适量硅胶(200目)用A溶剂浸泡后湿法装柱，柱子直径9 mm，装柱高度约12～13 cm。上样量0.5 mL，上样后先加14～15 mL A溶剂进行洗脱，再加20 mL B溶剂洗脱，最后加8 mL C溶剂洗脱，控制流速在1～2滴/s。收集各洗脱液，检测洛伐他汀主要分布在哪种溶剂及其纯度。

选择不同极性的有机溶剂，按极性从小到大列出3种洗脱方式，结果见表4。

表4 不同洗脱方式及结果Table 4 Different elution methods and results

由上表可知方式2得到的洛伐他汀粗品纯度较高，故选择方式2作为硅胶柱层析的洗脱方式，收集B洗脱液浓缩。

2.4.3 LH20柱层析

取Sephadex LH20用60%乙醇浸泡后湿法装柱，柱子直径9 mm，装柱高度4～5 cm，取洛伐他汀粗品浓缩液0.5 mL上样。上样后，先加5 mL超纯水进行洗脱，再加5 mL 20%甲醇洗脱，最后加5 mL 50% 甲醇洗脱，控制流速在1～2滴/s。收集各个洗脱液，检测洛伐他汀在各个溶剂中的含量及其纯度，结果见表5。

表5 不同洗脱液中洛伐他汀含量及纯度Table 5 Lovastatin content and purity in different elution liquid

洛伐他汀主要集中在20%甲醇洗脱液中，采用HPLC检测纯度，纯度达93%，色谱图见图16。收集5 mL 20%甲醇洗脱液，适当浓缩后得到纯化的洛伐他汀溶解液。

a-发酵液中洛伐他汀色谱图； b-分离纯化后洛伐他汀色谱图图16 洛伐他汀HPLC图谱Fig.16 HPLC chromatogram of lovastatin

实验结果表明，经LH20柱层析分离后，洛伐他汀纯度可达93%，得率45%；可见硅胶柱和LH20柱层析可有效去除杂质，获得高纯度的洛伐他汀。

3 结论

对红曲霉R”-30液态发酵产洛伐他汀的培养基组分和培养条件进行优化，得到最适培养基配方和发酵条件为：甘油30 g/L，黄豆粉15 g/L，ZnSO4·7H2O 6.6 g/L，KH2PO40.17 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，pH 5.0，装液量50 mL/250 mL，摇床转速150 r/min，30 ℃恒温培养，种子液培养64 h，接种量8%(体积分数)。

对红曲霉R”-30液态发酵过程洛伐他汀产量进行测定，洛伐他汀产量于第12天达到最大值，为615.3 mg/L，比优化前(312 mg/L)，提高了97.2%。红曲霉液态发酵所产的洛伐他汀主要为开环酸型。

对红曲霉R”-30液态发酵液中洛伐他汀进行分离纯化。发酵液先用6 mol/L NaOH溶液碱提，离心取上清；再通过硅胶柱和Sephadex LH20柱层析，经HPLC检测，洛伐他汀纯度达93%，得率为45%。