不同方法提取马齿苋多糖的抗氧活性比较

陈凌，陈召桂，骆卢佳，贾艳（嘉兴职业技术学院农业与环境分院，浙江嘉兴314036）

不同方法提取马齿苋多糖的抗氧活性比较

陈凌，陈召桂，骆卢佳，贾艳
（嘉兴职业技术学院农业与环境分院，浙江嘉兴314036）

摘要：用不同方法提取马齿苋多糖，并测定多糖含量及其粗多糖中蛋白质含量。采用体外试验研究马齿苋多糖对Fe3+、Ce4+的还原能力以及对超氧阴离子（O2-·）和羟自由基（·OH）的清除作用。结果表明，不同方法提取多糖的得率为：热水浸提>木瓜蛋白酶>纤维素酶>果胶酶>超声波辅助提取。其粗多糖中蛋白质含量是：果胶酶>纤维素酶>超声波辅助提取>热水提取>木瓜蛋白酶。在试验浓度范围，不同方法提取的马齿苋粗多糖对Fe3+和Ce4+的还原能力，热水提取最强，其次是果胶酶；用果胶酶提取的粗多糖对超氧阴离子自由基清除能力最强，其次是纤维素酶；对羟基清除能力，添加量为2.0m L时，纤维素酶最好，添加量为1.2mL时，果胶酶最好。从这4个方面综合来评价，果胶酶提取的马齿苋粗多糖抗氧化性最好。

关键词：马齿苋多糖；提取方法；氧自由基；抗氧化

马齿苋（Portolaca oleracea L．）为马齿苋科一年生肉质草本植物，马齿苋多糖具有杀菌、抗氧化和延缓衰老的作用。马齿苋对O2-·和·OH均有较强的清除能力[1]，马齿苋能增加兔血清超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低血清脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量。虽然大量文献报道了马齿苋多糖具有抗氧化活性[2-5]，其抗氧化作用与马齿苋多糖的含量、贮存时间及温度[6]有关，而马齿苋多糖的提取方法对其抗氧化活性的影响还鲜为人知。因此，分别采用热水浸提、乙醇浸提、超声波辅助提取、酶法提取马齿苋多糖，比较不同方法提取马齿苋多糖的得率、粗多糖中蛋白质含量及其抗氧化性，为高效利用马齿苋多糖的抗氧化活性提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

野生马齿苋：采自嘉兴职业技术学院校园内，经本院园艺教研室陈玉琴副教授鉴定。石油醚、氢氧化钠、无水乙醇、95%乙醇、浓硫酸、浓磷酸、浓盐酸、水杨酸、双氧水、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠，铁氰化钾，三氯乙酸，三氯化铁：上海联试化工试剂有限公司；Ce（SO4）2·4H2O：北京康普汇科技有限公司；抗坏血酸：天津博迪化工股份有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）：上海伯奥生物科技有限公司；邻苯三酚：遵义林源医药化工有限责任公司；等均为分析纯。考马斯亮蓝G-250：广州苏喏化工有限公司；牛血清白蛋白BR：上海展云化工有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力≧6 000 IU）：国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶（酶活力≧6 000 IU）、果胶酶（含量99%）：无锡百瑞多化工产品有限公司。

1.2仪器与设备

CP225D型1/10万电子分析天平：德国SATORIOS公司；KQ-100B型超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；RE-52C旋转蒸发器：巩义市英峪高科仪器厂；JP-500B-2型多功能粉碎机：上海市久品工贸有限公司；721N型分光光度计：上海海争电子科技有限公司；DK-S24型恒温水浴锅、DGG-9240BD型电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；Millipore超纯水仪、Smartpark DQ3纯水柱：美国等。

1.3马齿苋多糖的提取

新鲜马齿苋→洗净→50℃烘干→粉碎→石油醚脱脂→不同方法提取→离心分离→上清液浓缩→乙醇沉淀→过滤→多糖

1.3.1热水提取

称取马齿苋粉末5.002 1g，加入超纯水100.00mL，在80℃下浸提1.5 h，离心分离得上清液，将上清液减压浓缩至一定体积，加入3倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱过夜。次日，离心（3 500 r/min，20min）得多糖沉淀，用超纯水复溶得马齿苋多糖溶液B。

1.3.2超声法提取

称取马齿苋粉末5.002 0 g，按1∶20（g/mL）料液比加入超纯水，在功率100W下置50℃水浴中超声30min，再在50℃热水中浸提1 h。离心分离得上清液，将上清液减压浓缩至一定体积，加入3倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱过夜。次日，离心（3500 r/min，20min）得多糖沉淀，用超纯水复溶得马齿苋多糖溶液C。

1.3.3酶法提取

1.3.3.1木瓜蛋白酶

称取马齿苋粉末5.007 8 g，加入超纯水100.00m L，调pH=6.5，加入0.124 9 g木瓜蛋白酶，混匀，置50℃水中浸提1.5h[7]，升温至100℃灭活，离心分离得上清液，将上清液减压浓缩至一定体积，加入3倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱过夜。次日，离心（3500 r/min，20min）得多糖沉淀，用超纯水复溶得马齿苋多糖溶液D。

1.3.3.2纤维素酶

称取马齿苋粉末5.0085 g，加入超纯水100.00m L，调pH为6.0，加纤维素酶0.100 1 g，40℃酶解2 h[8]，升温至100℃灭活，离心分离得上清液，将上清液减压浓缩至一定体积，加入3倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱过夜。次日，离心（3 500 r/min，20min）得多糖沉淀，用超纯水复溶得马齿苋多糖溶液E。

1.3.3.3果胶酶

称取马齿苋粉末5.0004 g，加入超纯水100.00mL，调pH=4.5，加果胶酶0.050 97 g，40℃酶解1.5 h，升温至100℃灭活，离心分离得上清液，将上清液减压浓缩至一定体积，加入3倍体积无水乙醇，置于4℃冰箱过夜。次日，离心（3 500 r/min，20min）得多糖沉淀，用超纯水复溶得马齿苋多糖溶液F。

1.4测定方法

1.4.1马齿苋多糖含量测定

采用苯酚一硫酸法，以葡萄糖作为标准品，分光光度计测定溶液A、B、C、D、E、F的多糖含量[9]。

1.4.2蛋白质含量的测定

蛋白质分子均具有酰胺基团，棕红色的考马斯亮蓝G-250染料上的阴离子与蛋白质的酰胺结合，使溶液变为蓝色，其最大吸收峰为595 nm，蛋白质在1μg/m L～1 000μg/mL其吸光度与蛋白质含量成正比 （符合朗伯比尔定律），故可以用于测定蛋白质含量[10-11]。

1.4.2.1蛋白质标准曲线的绘制

蛋白质标准溶液：准确称取牛血清白蛋白50mg用少量蒸馏水溶解，定容于500.00mL容量瓶，即为100mg/L蛋白质标准储备液，4℃冰箱中保存。

考马斯亮蓝储备液：精密称取100mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50mL（蓝色），再加入浓H3PO4100mL（血红色），加水定容于200.00mL（褐色），4℃放置。考马斯亮蓝工作液：1份上述储备液，加4份水，混匀，过滤，临用前配制。

标准曲线绘制：在试管中分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液0、0．2、0．4、0．6、0．8、1.0mL，各管补加超纯水至1.0mL，配制成浓度为0、20、40、60、80、100mg/L的蛋白质标准溶液。然后在各支试管中分别加入5.00mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，在室温下反应5min。在595 nm波长处测定吸光度。以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求回归方程。

1.4.2.2粗多糖中蛋白质含量的测定

取溶液A、B、C、D、E、F各0.6mL，以空白试剂为参比，按上述标准曲线的测定法，分别测定其吸光度值，做3个重复，根据回归方程计算样品中蛋白质的含量。

1.4.3抗氧化性能的测定

1.4.3.1Fe3+总还原力的测定

采用铁氰化钾还原法，测对Fe3+的还原能力。取不同浓度的样品溶液各2.0 m L于一系列10m L的比色管中，加入pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL、1%铁氰化钾2.5mL，混匀后密封，50℃水浴20min，然后迅速冷却，加入10%的三氯乙酸2.5 m L，混匀并离心10 min （4 000 r/min）。取上清液5.0mL，再依次加入超纯水4.00mL和0.1%三氯化铁溶液1.0mL，充分混匀，37℃水浴静置10min，以超纯水为参比，在700 nm波长下测定其吸光度，吸光值大表明还原力强。

1.4.3.2Ce（Ⅳ）还原力的测定

采用Cerac法利用Ce（Ⅳ）/Ce（Ⅲ）之间的转化度，评价化合物的总还原能力。用分光光度计测定其吸光度，吸光度越小还原能力越强。

检测试剂的配制[12]：称取0.0809gCe（SO4）2·4H2O，加入25mL超纯水，17mL浓H2SO4，搅拌直至完全溶解，定容于100m L容量瓶中，得浓度为2.0×10-3mol/L Ce（SO4）2溶液。称取35.5 gNa2SO4于100mL烧杯中，加超纯水溶解，定容于250mL容量瓶后，缓慢加入54.64m L的浓硫酸，摇匀，冷却，得到Na2SO4溶液。检测试剂由1 706μLNa2SO4溶液、94μLH2O及0.2mL Ce（Ⅳ）溶液组成。

检测时，以超纯水为参比，波长320 nm，在比色管中加入Ce（SO4）210.00mL，分别加入不同浓度的系列样品0.1mL，混匀，37℃水浴静置10min后，测定吸收光谱。所有样品测试过程重复3次。试验中，将Ce（Ⅳ）吸光度下降程度（A0-A）/A0定义为还原率。

1.4.3.3羟自由基（·OH）消除率的测定

本试验采用了水杨酸捕获法，其原理是利用H2O2和Fe2+在水溶液中发生Fenton反应，生成羟自由基（·OH），反应方程式：H2O2+Fe2+→Fe3++·OH。水杨酸能够高效地捕捉·OH并生成有色物质，该物质在510 nm处有最大吸收峰，通过吸光度的变化可以衡量试样清除羟自由基的能力。以·OH氧化水杨酸所得产物的吸光值表示·OH的多少，吸光值越大，·OH越多。

羟自由基清除率的测定方法是依次加2mmol/L FeSO4和6 mmol/L H2O2各2.0 m L，混匀后再加入6 mmol/L水杨酸2.0mL，37℃水浴15min。然后分别加入不同浓度的样品溶液2.0mL摇匀，继续于37℃水浴加热15min加热完毕后以超纯水调零，于510 nm处测得其吸光度Ai，A0为用水代替样品时测得空白对照吸光度；Aj为用超纯水代替过氧化氢时的吸光度。并以VC对照。按以下公式计算各试样对羟基自由基（·OH）的清除率：

羟自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.4.3.4清除超氧阴离子（O2-·）能力的测定

邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化释放O2-·，并生成有色中间产物，该有色中间产物在325 nm波长处有一特征吸收峰，当有抑制剂存在时，可清除O2-·，从而阻止中间产物的积累，所以，可通过比色法来检测有色中间产物的含量，以检测物质清除O2-·的能力。吸光度越低，清除超氧阴离子自由基效果越好。

采用邻苯三酚自氧化法测O2-·的清除率：移取50mmol/L（pH8.2）的Tris-HCl缓冲溶液5.0mL于一系列比色管中，分别加入同一浓度马齿苋多糖液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL，再加水补充至5.8mL，摇匀，置于37℃水浴中预热20 min，再加入37℃预热的3mmol/L邻苯三酚0.20mL，立即混匀，4min时以空白（不加样品和邻苯三酚）作对照测定样品在325 nm处的吸光值Ai，A0为用超纯水代替样品时吸光值，各管对O2-·的清除率按下列公式计算。

超氧阴离子的清除率/%=[（A0-Ai）/A0]×100

2　结果

2.1不同方法提取马齿苋多糖的提取率

选择490 nm为马齿苋多糖含量测定波长，葡萄糖浓度在1.45mg/mL～10.15mg/mL范围内标准曲线的回归方程为：y=0.070 4x+0.018 3（R2=0.992 7），按此方程计算马齿苋多糖含量见表1。

表1　不同方法提取马齿苋多糖的提取率比较Table1　Differentextractionmethodsof purslane polysaccharide extraction rate

由表1可知，不同方法提取多糖的得率为：热水浸提＞木瓜蛋白酶＞纤维素酶＞果胶酶＞超声波辅助提取。

2.2不同方法提取马齿苋粗多糖中蛋白质含量

选择595 nm为蛋白质含量的测定波长，牛血清白蛋白浓度在20mg/L～100mg/L范围内标准曲线的回归方程为：y=0.007 1x+0.100 8（R2=0.990 7），根据此方程计算马齿苋粗多糖中蛋白质含量见表2。

表2　不同方法提取的马齿苋粗多糖中蛋白质含量Table 2　Different extractionmethodsof purslane in crudepolysaccharide protein content

由表2可知，木瓜蛋白酶提取的粗多糖中蛋白质的含量最少，这是因为木瓜蛋白酶分解了蛋白质；其次为热水，这是因为热水使蛋白质变性，在醇沉时去掉了一部分蛋白质；第三少的是超声波辅助提取，超声波也可使蛋白质变性，在浸提过程中除掉了一部分蛋白质。粗多糖中蛋白质含量为：果胶酶>纤维素酶>超声波辅助提取>热水提取>木瓜蛋白酶。

2.3对Fe3+还原能力

将这5种方法提取的多糖分别用超纯水定容于100mL容量瓶中，每一溶液依次在6支10mL比色管中加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，用超纯水补充到2.0mL，并按照1.4.3.1的方法对Fe3+还原能力进行测定，结果如图1所示。

图1　不同方法提取的马齿苋多糖对Fe3+还原能力Fig.1　Reducing ability of Portulaca oleracea L polysaccharidesby by differentm ethodson Fe3+

由图1得知，在所试浓度范围，马齿苋多糖对Fe3+具有显著的还原作用，且随着剂量的增加对Fe3+的还原能力也逐渐增强，呈量效关系。不同方法提取的马齿苋多糖对Fe3+还原能力为：热水提取>果胶酶>纤维素酶>木瓜蛋白酶>超声波辅助提取。

2.4对Ce（Ⅳ）还原能力

将提取的多糖用超纯水定容于100mL容量瓶，依次取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL加入10mL比色管中，加超纯水至刻度，摇匀后取此稀释液0.1mL，再按照

1.4.3.2的方法进行Ce（Ⅳ）还原能力的测定，结果如图2所示。

图2　不同方法提取的马齿苋多糖对Ce4+还原能力Fig.2　Reducing ability of Portulaca oleracea L polysaccharidesby by differentmethods on Ce4+

从图2可知，在所试浓度范围，马齿苋多糖对Ce4+具有显著的还原作用，且随着剂量的增加对Ce4+的还原能力也逐渐增强，呈良好的线性关系。不同方法提取的马齿苋多糖对Ce4+还原能力为：热水提取最高，其次是果胶酶，再其次是超声波和木瓜蛋白酶，最低的是纤维素，在添加量小于0.4mL时超声波辅助提取>木瓜蛋白酶，添加量大于0.4mL时超声波辅助提取<木瓜蛋白酶。

不同方法提取的马齿苋多糖对Fe3+和Ce4+的还原能力，热水提取最强，其次是果胶酶。热水提取的多糖含量最高，其蛋白质含量排第四；果胶酶提取的多糖含量为第四，其粗多糖中蛋白质含量最高。木瓜蛋白酶的还原能力为第四，其多糖含量为第二，其蛋白质含量为最少。因此不同方法提取的马齿苋多糖对Fe3+和Ce4+的还原能力不但与多糖含量有关，还与不同方法提取的多糖的结构和组成有关，与蛋白质的含量似乎无关（因为纤维素酶解法提取的多糖含量比果胶酶高0.02%，而其中蛋白质含量比其低0.03%，其多糖对Fe3+和Ce4+的还原能力比果胶酶低很多）。

2.5对羟自由基（·OH）清除能力

将提取的多糖用超纯水定容于100mL容量瓶，依次取0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL加入10mL比色管中，用超纯水补充到2.0 m L作为不同浓度的样品溶液，按照1.4.3.3的方法进行·OH清除率的测定，结果如图3所示。

从图3看出，不同方法提取的马齿苋多糖对·OH清除能力随添加量的增加而增强。在试验浓度范围内，变化幅度最大的是纤维素酶。添加量为2.0mL时，不同方法提取的马齿苋多糖对·OH清除能力都强于VC，此时的清除率为：纤维素酶>木瓜蛋白酶>超声波辅助提取>热水提取>果胶酶>VC。添加量为1.2m L时，果胶酶对·OH的清除率最大；添加量大于1.2mL时，木瓜蛋白酶对·OH的清除率最大。

图3　不同方法提取的马齿苋多糖对·OH的清除率Fig.3　Radical scavenging actⅣities of Portulaca oleracea L polysaccharidesby by differentm ethodson hydroxyl radicals

2.6对超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力

将这5种方法提取的多糖分别用超纯水定容于100mL容量瓶中，按照1.4.3.4的方法对O2-·清除率进行测定，结果如图4所示。

图4　不同方法提取的马齿苋多糖对O2-·的清除率Fig.4　Radicalscavenging actⅣitiesof Portulaca oleracea L polysaccharidesby by differentmethodson superoxidenegatⅣe ion free radicals

马齿苋多糖对O2-·具有显著的清除作用，且随着剂量的增加对O2-·的清除作用也逐渐增强，呈量效关系。在所试浓度范围，果胶酶提取的多糖对超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力最强，其次是纤维素酶，在添加剂量小于0.3mL时超声波辅助提取>热水提取>木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶提取的多糖对O2-·的清除作用量效关系最显著（见图4）。虽然热水提取的多糖含量最高，但清除O2-·和·OH自由基的能力并不是最好，这可能与不同提取方法提取的多糖的组成和结果有关，这有待今后进一步研究。

3　结论

1）不同方法提取的马齿苋多糖的得率为：热水浸提>木瓜蛋白酶>纤维素酶>果胶酶>超声波辅助提取。不同方法提取的粗多糖中蛋白质含量：果胶酶>纤维素酶>超声波辅助提取>热水提取。

2）不同方法提取的马齿苋粗多糖对Fe3+和Ce4+的还原能力：热水提取最强，其次是果胶酶；果胶酶提取的粗多糖对超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力最强，其次是纤维素酶；对羟基（·OH）清除能力，添加量为2.0mL时，纤维素酶最好，添加量为1.2m L时，果胶酶最好。

3）在所试浓度范围，从马齿苋粗多糖对Fe3+和Ce4+的还原能力、对羟基和超氧阴离子自由基的抗氧化能力这4个方面来看，果胶酶提取的马齿苋粗多糖抗氧化性最好。马齿苋粗多糖的抗氧化性与其多糖的含量及提取方法有关，提取方法不同多糖的结构和组成可能不同，从而影响其抗氧化性，这有待今后进一步研究。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.004

收稿日期：2015-08-24

基金项目：化工资源有效利用国家重点实验室开放课题（CRE-2014-C-302）；嘉兴市科技计划项目（2015AY21004）

作者简介：陈凌（1962—），女（汉），副教授，学士，研究方向：植物源食品抗氧化剂。

The Comparison of Antioxidant Activity of Polysaccharides Extracted from Purslane by Different W ays

CHENLing，CHEN Zhao-gui，LUO Lu-jia，JIA Yan
（Agriculture and EnvironmentalBranch，Jiaxing Vocational TechnicalCollege，Jiaxing314036，Zhejiang，China）

Abstract：Purslane polysaccharide extracted by different methods，and determination of the content of polysaccharide and protein content.Using in vitro experimental study of purslane polysaccharide on Fe3+，Ce4+reduction ability and the superoxide anion（O2-·）and hydroxyl radical（·OH）scavenging effect.The results showed that，for the rate of polysaccharide extracted with differentmethods：hotwater extraction>papain> cellulase>pectinase>ultrasonic-assisted extraction.Theprotein contentof the crudepolysaccharide：pectinase> cellulase>ultrasonic extraction>hotwater extraction>papain.In the experimental concentration range，the reduction capabilityofpurslane polysaccharide on Fe3+and Ce4+：hotwater extractionwas strongest，followed by pectinase.The crude polysaccharide scavenging superoxide anion free radical by pectinase extraction had the strongest ability，followed by cellulose.Adding amountwas 2.0 m L，cellulase on hydroxyl scavenging ability was the best，adding amountwas1.2mL，the bestof pectinase.From these four aspects to evaluate，pectinase extraction ofpurslane crudepolysaccharideantioxidationwas thebest.

Keywords：Portulaca oleracea L.polysaccharide；extractionmethod；oxygen free radicals；antioxidaion