蔓越莓抑制UVB诱导HaCaT细胞氧化损伤和凋亡的研究

刘硕，邝梦婷，朱华伟，林勇，*（.湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙408；.无限极（中国）有限公司，广东广州5063）

蔓越莓抑制UVB诱导HaCaT细胞氧化损伤和凋亡的研究

刘硕2，邝梦婷1，朱华伟2，林勇1，*
（1.湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙410128；2.无限极（中国）有限公司，广东广州510623）

摘要：研究蔓越莓对中波紫外线（UVB）诱导的人表皮角质形成细胞（HaCaT）光损伤的保护作用。用3个不同剂量的蔓越莓果汁预处理HaCaT细胞6 h，采用60m J/cm2强度UVB照射细胞；然后用MTT法检测细胞的生存率，吸取细胞上清液采用比色法检测丙二醛（MDA）、羟脯氨酸（Hyp）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、乳酸脱氢酶（LDH）的活性变化，用荧光法检测细胞内活性氧自由基（ROS）含量，用倒置显微镜和流式细胞仪观察检测细胞凋亡状况。UVB辐射对HaCaT细胞造成比较严重的损伤；相比于空白对照组，UVB辐射模型组HaCaT细胞活性下降了29.54%，SOD和GSH-Px活性极显著降低（P<0.01）；相比于模型组，蔓越莓各剂量组可显著提高UVB照射后HaCaT细胞的活力（P<0.05或P<0.01），提高SOD和GSH-Px活性（P<0.01），减少MDA和ROS含量（P<0.05或P<0.01），并且降低LDH活性和增加Hyp含量（P<0.01），呈剂量依赖关系，从而降低UVB所导致的细胞损伤及凋亡率升高。蔓越莓可以明显减少UVB诱导HaCaT细胞的氧化损伤和凋亡，具有显著的光保护功效，其作用机制与增强细胞抗氧化能力、加速清除氧自由基以及促进胶原蛋白合成有关。

关键词：蔓越莓；HaCaT细胞；中波紫外线（UVB）；氧化损伤；凋亡；抑制作用

皮肤光老化是皮肤外源性老化的一个重要组成，长期紫外线辐射是环境中促使皮肤老化的最重要因素[1]。紫外线辐射可诱导皮肤细胞产生大量高活性自由基，能破坏皮肤的抗氧化系统，从而使自身抗氧化酶活性降低并导致脂质过氧化物堆积[2-3]。同时过量高活性自由基亦能导致DNA氧化损伤，进而造成DNA链断裂和碱基氧化，从而诱导细胞凋亡甚至诱发皮肤癌变等疾病[3]。在紫外线辐射中，对人体皮肤产生影响的主要是长波紫外线（ultraviolet radiation A，UVA，320 nm～400 nm）和中波紫外线（ultraviolet radiation B，UVB，280 nm～320 nm），而且相同剂量UVB的生物学效应大约是UVA的800倍～1000倍[4]。已有大量研究表明，UVB是造成皮肤光老化的最主要因素[5]，也是皮肤癌发生的重要因素[6]，使用UVB照射建模可诱导动物皮肤光老化[7]。为了减轻UVB辐射对皮肤细胞的光损伤，应用抗氧化剂已是人们保护皮肤的有效措施[8-9]。蔓越莓（Cranberry）是越桔属植物，素有“北美红宝石”之称，在我国的大兴安岭地区也比较常见[10]；2007年美国卫生部对常食用水果的抗氧化能力进行评估，蔓越莓高居榜首[11]。蔓越莓的超强抗氧化能力可能与其含有丰富的黄酮类、香豆素、酚类以及萜类等天然活性物质有关[12]，从而造就了其延缓衰老、抗感染、抗肿瘤、防治消化系统疾病、保护口腔和牙齿等多种特殊功能[13]。尤其蔓越莓中富含的原花青素（一种生物类黄酮），是国际上公认的清除人体自由基最有效的天然抗氧化剂，其抗氧化能力达到VE的50倍[13]。当前关于蔓越莓保健及药理功效的研究国外主要集中在抗感染、抗氧化、抗癌等方面，国内文献报道很少[14]。因此，国内开展关于我国蔓越莓资源的功效研究很少，特别是关于蔓越莓对UVB光损伤的人表皮角质形成细胞（HaCaT）的保护作用未见报道。基于此，本研究通过UVB诱导HaCaT细胞氧化损伤，建立体外光老化细胞模型，观察蔓越莓对UVB导致HaCaT细胞氧化损伤和凋亡的影响并探讨相关抗光老化机理，旨在为我国蔓越莓资源利用以及新型抗皮肤光老化产品开发提供科学依据和科技支撑。

1　材料与方法

1.1细胞和蔓越莓果汁冻干粉

HaCaT细胞株（人永生化表皮角质形成细胞）：由武汉大学典型物保藏中心提供；蔓越莓果汁冻干粉：由无限极（中国）有限公司提供。

1.2仪器与试剂

SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；CO2培养箱：美国Nuaire公司；UVP紫外交联仪：美国思博明科学器材公司；DMIL-LED倒置显微镜：德国Leica公司；Varioskan Flash多功能酶标仪：美国Thermo公司；FACsort流式细胞仪：美国BD公司；UV-2501紫外分光光度计：日本Shimadzu公司；MH-1微型振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Rotina离心机：德国Hettich公司；AEU-210电子天平：长沙湘仪天平仪器公司。

MEM培养基、胰蛋白酶：购自美国Gibco公司；胎牛血清：购自美国Hyclone公司；四甲基偶氮唑蓝MTT粉、PBS粉剂、DMSO：购自美国Amresco公司；丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、乳酸脱氢酶LDH、羟脯氨酸Hyp试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；二氯荧光黄双乙酸盐DCFH-DA购自美国Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒由碧云天生物技术研究所提供；细胞凋亡检测试剂盒由南京凯基生物科技发展有限公司提供；N，N-二甲基甲酰胺、冰醋酸、甲醇购自湖南汇虹试剂有限公司。

1.3细胞培养及蔓越莓对细胞增殖的影响

HaCaT细胞用含10%胎牛血清的MEM培养液于37℃、5%CO2的条件下的细胞培养箱中贴壁培养。待细胞融合90%以上时传代，经0.5%胰蛋白酶消化后用含10%胎牛血清的MEM培养基以1×105个/mL细胞密度接种于96孔培养板中。当细胞融合80%时，加入含有不同浓度蔓越莓果汁的培养液（不含血清）；处理细胞24 h后，弃掉原培养基并用PBS冲洗1次后，换用含10%胎牛血清MEM培养基进行继续培养。计算HaCaT细胞增殖的抑制率/%=（空白对照组OD－各处理组OD）/（空白对照组OD）×100。

1.4细胞分组处理

HaCaT细胞接种到96孔细胞培养板，待细胞融合80%以上后，分为空白对照组（MEM培养基培养细胞6 h，不用UVB辐射）、UVB辐射模型组（MEM培养基培养细胞6 h，再采用UVB辐射）、蔓越莓处理组（HaCaT细胞分别用含上述1.3试验挑选的3个浓度的蔓越莓的MEM培养液培养6 h后，再采用UVB辐射，分别记作蔓越莓低、中、高剂量组）。每组细胞都有6个复孔，弃去细胞培养基，加入适量PBS来覆盖细胞，再用60mJ/cm2剂量UVB辐射，空白对照组需用铝箔覆盖。弃去PBS后，加入10%胎牛血清MEM培养基于培养箱中继续培养24 h。计算出HaCaT细胞存活率=（各处理组OD）/（空白对照组OD）×100%。

1.5指标测定方法

测定HaCaT细胞增殖活性：每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，孵育5 h后弃去上清，再加入150μL DMSO，置于微型振荡器上低速振荡8min，多功能酶标仪测定570 nm波长处吸光值（OD570nm值）。

测定MDA、SOD、GSH-Px、Hyp和LDH含量或活力：按照1.4步骤处理各组细胞后，收集各组上清液，并根据各试剂盒说明书来进行MDA、SOD、GSH-Px、Hyp及LDH活性或含量的测定。

检测细胞内活性氧ROS含量：UVB辐射后30min收集细胞，弃去原培养基；再加入含10μmol/mL DCFH-DA的无血清培养基，于37℃、5%CO2条件的培养箱孵育25min；再用无血清培养液冲洗4次，使未进入细胞的DCFH-DA得到充分去除[15]。采用488 nm激发波长和525 nm发射波长对氧化型二氯荧光素（DCF）的荧光强度进行检测。

检测细胞凋亡率：根据1.4操作培养于六孔板中的HaCaT细胞，用0.5%胰蛋白酶消化收集细胞，再稀释成106个/mL单细胞悬液；然后吸取细胞悬液于离心管中，在4℃、2 000 r/min条件下离心10min，弃去上清液并用PBS冲洗3次，再加入200μL的Binding Buffer来悬浮细胞，避光加入Annexin V-FITC试剂5μL并混匀，再加入Propidiun Iodide试剂5μL混匀，避光室温反应10min左右，然后在1 h内进行流式细胞仪检测[16]。

1.6数据分析

运用SPSS17.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差（±s）来表述，组间比较采用单因素ANOVA方差分析。

2　结果与分析

2.1蔓越莓对HaCaT细胞增殖的影响

蔓越莓对HaCaT细胞增殖的影响见图1所示。

图1　蔓越莓对HaCaT细胞增值的影响Fig.1　Effectof cranberry on thegrow th of HaCaT cells

蔓越莓果汁对HaCaT细胞增殖具有一定的抑制作用，且抑制率随给药浓度的增加而增加；特别是当给药浓度大于50mg/mL，蔓越莓果汁对细胞增殖的抑制效果很明显，呈直线上升趋势。考虑到给药浓度小于50mg/mL时，对细胞增殖影响不大（抑制率小于10%），因此，蔓越莓12.5、25和50mg/mL 3个质量浓度被设定为蔓越莓低、中和高剂量来应用于后续的实验。

2.2蔓越莓对UVB辐射HaCaT细胞活性的影响

蔓越莓对UVB辐射HaCaT细胞活性的影响如表1所示。

表1　不同处理条件下HaCaT细胞的活性Table1　Viability of HaCaT cells atdifferent treatm ent conditions

UVB模型组细胞活性较空白对照组显著降低，具有统计学意义（P＜0.01）。随着蔓越莓各处理组给药剂量的逐步增大，HaCaT细胞活性提高比较明显，均与模型组呈显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），且呈剂量依赖关系，从而表明蔓越莓果汁能够有效地抵御UVB辐射对细胞活性的抑制。

2.3蔓越莓对UVB辐射HaCaT细胞的MDA、SOD和GSH-Px含量的影响

蔓越莓对UVB辐射HaCaT细胞的抗氧化能力的影响见表2所示。

表2　不同处理下HaCaT细胞的MDA、SOD和GSH-Px含量Table2 M DA，SOD and GSH-Px contents of HaCaT cellsw ith different treatments

与空白对照组相比，UVB模型组细胞培养液中MDA含量明显上升，而SOD和GSH-Px的活力明显下降，变化达到极显著水平（P＜0.01），此结果表明HaCaT细胞正常的抗氧化能力损伤明显。而与模型组比较，蔓越莓各处理组随着给药浓度的逐步加大，MDA含量具有下降趋势，细胞培养液中SOD和GSHPx活力均具有上升趋势，且变化均达到极显著水平（P＜0.01）。从而表明蔓越莓果汁的处理能一定程度地修复UVB对HaCaT细胞的氧化损伤。

2.4蔓越莓对UVB辐射HaCaT细胞的LDH活力和Hyp含量的影响

多功能酶标仪检测结果如表3所示。

表3　不同处理下HaCaT细胞的LDH活力和Hyp含量Table3　LDH activity and Hyp contentof HaCaT cellsw ith different treatments

与空白对照组比较，UVB模型组细胞培养液中LDH活性显著升高，Hyp含量明显下降，差异达到极显著水平（P＜0.01）。而与模型组比较，蔓越莓各处理组预处理细胞24 h后再用UVB照射，细胞培养液中LDH活性极显著降低和Hyp含量极显著提高（P＜0.01），从而说明蔓越莓果汁对UVB损伤具有防护作用，不仅保护细胞膜的结构和功能的完整性，而且能促进细胞胶原蛋白合成。

2.5蔓越莓对UVB辐射HaCaT细胞内ROS含量的影响

蔓越莓对UVB辐射HaCaT细胞内ROS含量的影响见表4所示。

表4　不同处理下HaCaT细胞内ROS含量Table4　The contentofROSin HaCaT cellsw ith different treatments

与空白对照组相比，UVB辐射模型组细胞内氧自由基ROS含量极显著升高（P＜0.01），几乎达到了2倍的水平。而与模型组比较，蔓越莓各处理组可明显降低细胞内ROS含量，均达到显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），且各组呈剂量依赖性关系。

2.6蔓越莓对UVB辐射HaCaT细胞凋亡的影响

倒置显微镜观察如图2A～2C所示，与空白对照组（图2A）相比较，HaCaT细胞经UVB辐射后，细胞数量极显著减少（图2B）。而与模型组比较，加入高剂量的蔓越莓果汁孵育后，再接受UVB辐射，HaCaT细胞数目明显增多，并且细胞形态也基本正常（图2C）。从而直观表明蔓越莓果汁具有一定的防紫外线辐射能力。

流式细胞仪分析如图2D～2F所示，空白对照组的正常细胞占91.42%（左下象），UVB模型组占74.03%，蔓越莓高剂量组占82.85%。这些结果表明，与空白正常组对比，模型组细胞存活率下降了17.42%；而与模型组比较，蔓越莓高剂量组细胞存活率提高了8.82%，从而进一步说明蔓越莓果汁可以有效抵御紫外辐射导致的细胞凋亡。

3　结论

图2　各处理组HaCaT细胞的状态和凋亡情况Fig.2　Effectsofdifferent treatmentson the statusand apoptosisofHaCaT cells

长期紫外线辐射会诱导细胞产生许多高反应活性的氧自由基，从而使皮肤抗氧化体系遭受破坏，促使机体氧化与抗氧化系统失衡严重，从而进一步诱发氧化应激产生大量的活性氧自由基；过量的高反应活性自由基会攻击细胞，引起氧化产物MDA增加和导致脂质过氧化，并可能引起细胞凋亡发生、突变增加甚至导致皮肤癌等严重疾病[2-3]。SOD，GSH-Px等抗氧化酶构成了机体重要的抗氧化体系，能够减少活性氧自由基和过氧化代谢产物的产生堆积[17]，从而降低细胞氧化损伤和凋亡状况。同时，为了减弱紫外线尤其UVB辐射所引起的光损伤，应用天然抗氧化剂成为人们保护皮肤的有效措施[8-9]。

蔓越莓是越桔属植物，又称蔓越橘，素有“北美红宝石”之称，在我国的大兴安岭地区也比较常见[10]；2007年美国卫生部对常食用水果的抗氧化能力进行比较和评估，蔓越莓高居榜首[11]。HaCaT细胞是人皮肤中分离的一种永生化的角质形成细胞，保持有正常人角质形成细胞的分化和增殖特性，常用来替代人表皮角质形成细胞进行光老化体外细胞试验研究。在本研究中，UVB辐射损伤HaCaT细胞呈典型的凋亡形态学改变，而经过蔓越莓果汁尤其是高剂量预孵育的HaCaT细胞损伤程度明显减轻。说明蔓越莓对UVB辐射损伤的人表皮角质形成HaCaT细胞具有光保护作用，并可能与蔓越莓抑制UVB辐射引起的细胞氧化损伤和凋亡，增强其抗氧化能力有关。随后抗氧化指标的结果显示，蔓越莓可以显著提高SOD、GSH-Px活性，加速活性氧自由基的清除以及减少氧自由基的产生，从而使UVB辐射导致的HaCaT细胞脂质过氧化损伤程度明显减轻。已有报道也指出蔓越莓的抗氧化机制可能是在其所含丰富的原花青素（34.3mg/100 g）、槲皮素（25mg/100 g）、VC（13.5mg/100 g）、花青甙、β-胡萝卜素等功效因子的综合作用下通过抑制活性氧自由基的产生，清除过量自由基，提高机体抗氧化酶体系活力等多方面来完成[12，18]。尤其蔓越莓中富含的原花青素，是国际上公认的清除人体自由基最有效的天然抗氧化剂，其抗自由基氧化能力是VE的50倍[13]；它能有效地降低超氧根阴离子自由基和羟自由基的含量，从而有效地控制细胞脂质过度氧化，还进一步保护细胞DNA免受自由基引起的氧化损害[18-19]。

此外，过量的紫外线照射会破坏细胞膜的脂层结构，造成细胞膜通透性变大，导致细胞内乳酸脱氢酶（LDH）外泄进入到细胞培养液中，LDH漏出率成为反映细胞膜损伤的重要指标[20]。羟脯氨酸（Hyp）主要存在于胶原蛋白中，其含量的多少直接反应出胶原蛋白的合成能力[9]，过量紫外线照射会影响细胞胶原蛋白的合成能力。在本研究中，蔓越莓果汁也显著降低UVB辐射HaCaT细胞培养液中LDH的活性和增加Hyp的含量。这样一方面蔓越莓保护了细胞膜结构和功能的完整性，能抵抗活性氧自由基对肌肤细胞的损伤，从而延缓皮肤光老化；另一方面能为肌肤提供营养元素，促进胶原蛋白合成，使肌肤变得年轻健康，具有极佳的养颜美容功效。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.002

收稿日期：2015-06-29

基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目（IRT0963）

作者简介：刘硕（1982—），男（汉），工程师，硕士，研究方向：植物功能成分利用

*通信作者：林勇（1981—），男，讲师，博士，研究方向：植物功能成分利用。

Study on the Inhibition Effects of Cranberry on UVB-induced Oxidative Damage and Apoptosisof HaCaT Cells

LIUShuo2，KUANGMeng-ting1，ZHUHua-wei2，LINYong1，*
（1.NationalResearch Centerof Engineering&Technology for Utilization ofBotanicalFunctional Ingredients，Hunan AgriculturalUniversity，Changsha 410128，Hunan，China；2.Infinitus（China）Company Ltd，Guangzhou 510623，Guangdong，China）

Abstract：To study the photo-protection effectof cranberry on HaCaT cells damaged by ultraviolet radiation B （UVB）.HaCaT cellswere first incubated for six hourswith three different doses of cranberry juice，and then irradiated with 60 mJ/cm2dose of UVB.The cell viability was detected by the MTTmethod.The level of malondialdehyde（MDA），hydroxyproline（Hyp）and the activitesofsuperoxidedismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px），lactate dehydrogenase（LDH）ofsupernatantswere determined with the colorimetric methods.The contentofintra-cellular reactive oxygen species（ROS）was testedwith the fluorescencemethod. Compared with the controlgroup，the UVB irradiation could seriously damageHaCaT cells，which lead to29.54% decline in cellviability and obviousdecrease in SOD and GSH-Px activities（P<0.01）.Importantly，compared with the UVBmodel group，cranberry could obviously enhance cell viability（P<0.05 or P<0.01），increase SOD，GSH-Px activities and Hyp content，decrease LDH activity and the contents of MDA and ROS in supernatants under UVB irradiation in dose-dependentmanner（P<0.01 or P<0.05），which lead to thedecreased rate in cell damage and apoptosis.In conclusion，cranberry could relieve UVB-induced oxidative damage and apoptosis of HaCaT cells and exhibit the photo-protection effect，which might be the reasons that cranberryefficiently enhanced the oxidase activity，cleared the oxy-radicals and stimulated the collagen synthesis in cells.

Key words：cranberry；HaCaT cell；ultraviolet radiation B（UVB）；oxidative damage；apoptosis；inhibition effect