适合金银花不同组织总RNA提取方法的筛选

易刚强��+蔡嘉洛��+朱贻霖��+张亚利��+刘峰��+刘湘丹��+高昱��+童巧珍��

摘要：对Trizol法、CTAB法、十二烷基磺酸钠（SDS）法、多糖多酚试剂盒法、改良多糖多酚试剂盒法5种RNA提取方法提取金银花叶片、茎、根、花蕾组织RNA的效果进行比较，以期获得质量较好的金银花不同器官的RNA，为后续分子生物学试验奠定基础。结果表明：改进后的多糖多酚试剂盒法能够克服金银花中RNA提取难度大的问题，能够提取到质量、产量都很高的RNA，且稳定性好、无DNA污染，可以满足进一步的半定量反转录PCR（RT-PCR）等试验需要。

关键词：金银花；不同组织；总RNA；提取方法；改良多糖多酚试剂盒

中图分类号： S184文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0063-03

金银花（Floe Lonicerae）别称忍冬花、银花等，为忍冬科（Capfifoliaceae）忍冬属（Lonicera）植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）以及同属多种植物的干燥花蕾及其初开的花，具有清热解毒、凉散风热等功效[1]。当前，随着人们消费水平的提高及对中药材日益增长的需求，提高金银花的绿原酸产量、品质已经具有重大意义。有研究表明，在金银花绿原酸研究中，对控制绿原酸等活性物质相关酶基因在金银花不同部位的表达模式进行分析极其重要；同时，反转录PCR（RT-PCR）、cDNA文库构建等都需要高质量的RNA。目前，金银花总RNA提取方法包括Trizol法、SDS法等[2-4]。本研究以金银花根、茎、叶、花蕾为材料，通过对Trizol法、CTAB法、SDS、多糖多酚试剂盒法、改良多酚试剂盒法行比较，探索从富含多糖的金银花组织中提取高质量、无DNA污染的RNA方法，以期为金银花分子生物学研究及提高其活性成分含量研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

供试材料为金银花的叶片、根、茎、花蕾。均取自湖南省隆回县金银花产业化种植基地（均由湖南中医药大学药学院周日宝教授鉴定为正品）。

RNA提取过程中使用的枪头、枪头盒、离心管等塑料器皿均用0.1% DEPC水浸泡4 h后高压蒸汽灭菌、烘干，研钵用75%乙醇润洗消毒。试验中所用提取液以及各种液态试剂均用0.1% DEPC水配制，于37 ℃放置过夜以抑制RNase活性。研钵、药匙及玻璃器皿用铝箔纸包好后于180 ℃烘箱中干热灭菌6～8 h。

各种试剂配制参照《分子克隆实验指南》进行。各种方法提取总RNA均定容为20 μL，重复试验3次。

1.2RNA提取方法

每种材料均比较了CTAB法[5-6]、SDS法[7-8]、Trizol法[9]、多酚多糖试剂盒法、改良多酚多糖试剂盒法提取RNA的效果。

1.2.1改良CTAB法称取0.2 g样品，参照孟丽等CTAB法[10]并略加改进进行提取（改进措施：①尽量采收幼嫩的植物组织作为提取DNA的材料；②将采集的样品及时放入液氮中；③在DNA缓冲液中加入β-巯基乙醇的用量达2.5%～3.0%；④在提取获得的DNA样品中加入RNase）。

1.2.2Trizol法称取0.2 g样品，参照陈静等的Trizol法[9]进行提取。

1.2.3SDS法称取0.2 g样品，参照王暑辉等SDS法[4]进行提取。

1.2.4多糖多酚试剂盒法称取0.2 g样品，按照Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公司）说明书进行规范化操作。

1.2.5改良的多糖多酚试剂盒法称取0.2 g样品，按照浙江BioFlus多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书，在步骤3后添加等体积酚-三氯甲烷抽提这一步骤；同时，每步操作均在冰盒内进行；在最后的DEPC处理水定容阶段，将原来的50 μL改为20 μL；其他过程同试剂盒说明书[11-12]。

1.2.6RNA完整性检测分别取1 μL各器官的总RNA，在1.0%质量浓度的凝胶上分析RNA的完整性、质量。由于通常情况下，总RNA研究中的利用特點与要求，主要依据28S、18S rRNA凝胶电泳时所形成的谱带特征。如果带型清晰且亮度高，则表明所提取到的RNA样品量大且质量高，而且以28S rRNA谱带亮度高于18S rRNA更佳。同时，根据电泳结果还可以判断RNA样品中有无DNA、蛋白污染。

1.2.7总RNA纯度、浓度测定分别取1 μL根、茎、叶、花蕾的总RNA，稀释50倍后用核酸测定仪（Eppendorf，Biophotometer plus 6132），分别测量230、260、280 nm处的吸光度并计算D260 nm/D280 nm值、D260 nm/D230 nm值和RNA得率。

1.2.8半定量RT-PCR方法根据试验中高通量测序中金银花β-actin序列设计1对引物：β-actin-F：5′-AGGAACCACCGATCCAGACA-3′；β-actin-R：5′-GGTGCCCTGA GGTCCTGTT-3′。利用cDNA末端快速克隆（rapid-amplification of cDNA ends，RACE）合成金银花[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]基因cDNA序列，设计目的基因RT-PCR反应引物：[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]-F：5′-ATGGGTCGAGGGAAGATTGAGA-3′；[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]-R：5′-TATGCCCATTTGACTCTCAGAG-3′。

以提取金银花各器官的总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共25个循环；72 ℃ 10 min。

2结果与分析

2.1RNA纯度及浓度测定

2.2RNA完整性分析

用改良CTAB法提取的金银花根、茎、叶、花蕾总RNA，本研究只对花蕾、嫩叶片的RNA电泳图进行分析，根、茎、电泳图未列出。

分别取5 μL RNA样品，在1.0%非变性琼脂糖凝胶上进

行电泳检测。图1-a为SDS提取法电泳结果，可见RNA条带明显，但拖尾严重，且5S条带较亮，说明RNA存在很大程度的降解；同时，可见样品有较为严重的DNA污染。图1-b为改良CTAB提取法电泳结果，图中28S、18S条带清晰，28S条带的亮度约为18S条带亮度的2倍，5S条带隐约可见，未见DNA污染。图1-c为Trizol法电泳结果，图中未见RNA条带。图1-d为多糖多酚试剂盒法電泳结果，图中28S、18S条带清晰，28S条带的亮度约为18S亮度的2倍，5S条带隐约可见，但可见轻微DNA污染。图1-e为改良的多糖多酚试剂盒法电泳结果，图中28S、18S条带清晰，28S条带的亮度约为18S亮度的2倍，未见DNA污染。[FL）]

[FK（W+64mm][TPYGQ1.tif][FK）]

[FL（2K2]结合图1、表1分析可知：SDS法、Trizol法提取的样品，无法满足后续试验要求；改良CTAB法、多糖多酚试剂盒法、改良多糖多酚试剂盒法所提取的样品纯度高、完整性好，基本满足后续试验要求。

2.33种提取法提取各器官总RNA半定量RT-PCR检测结果

根据笔者所在实验室高通量测序及RACE技术得到金银花基因设计引物，以改良CTAB法、多糖多酚试剂盒法、改良多糖多酚试剂盒法提取的金银花根、茎、叶、花蕾总RNA为模板进行半定量RT-PCR（β-actin基因为内参基因）。由图2可知，改良多糖多酚试剂盒提取法PCR扩增效果最佳，同时也表明[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]基因在金银花各部位中都有表达，在花蕾中表达量最高，在根、叶中的表达量次之，在茎中最低。与已有文献报道的同源基因结果基本一致，说明改良多糖多酚试剂盒提取法提取的金银花各器官的总RNA质量较好，可以进行半定量RT-PCR等后续分子生物学试验。

3讨论

大量研究表明，虽然植物RNA的提取方法有多种[13-15]，但是所获得的RNA质量各有差异。由于不同植物组织成分的差异，其最适用的提取方法也不尽相同。特别是多酚、多糖含量高的植物材料，内源、外源RNA酶含量丰富。在完整的植物细胞内，这些物质与核酸是分离的；一旦细胞碎裂，即与RNA相互作用，影响高质量RNA的提取，导致各组织RNA提取过程中常出现产量低、质量差、易降解等问题，有时甚至不能用于相关研究。因此，RNA提取一直是影响金银花分子生物学研究的难点，在RNA提取的整个过程中，除了保证环境的干净、操作过程中不要引入杂质及细菌外，重点要除净细胞里的多糖、多酚、蛋白质及DNA等杂质，并不要残留提取过程中所加入的试剂。

从不同提取方法的试验结果比较分析可知，Trizol法、SDS法不能提取样品中的RNA，而广泛应用于多糖多酚样品的改良CTAB法能提取出效果较好的RNA；同时，使用有针对性的多糖多酚试剂盒则能提取出效果最好的RNA，证明金银花样品多糖多酚类成分含量很高。对于不同植物种类，体内积累的次生代谢产物不同，由于化学组分差异，没有一种适合所有植物核酸的提取方法。因此，在进行植物样品总RNA提取前，首先应了解样品的性质，根据其所含相关次生代谢产物，选择适合该样品的有效提取方法，提取出高质量的RNA，以便继续下一步的试验操作。

本试验中改良CTAB法能提取出质量较好的总RNA，且基本能满足后续试验的要求，但相对多糖多酚试剂盒、改良多糖多酚试剂盒法来说，效果较差。经过分析，可能存在以下几个方面的原因：（1）CTAB法提取需要LiCl沉淀过夜，提取周期长，而多糖多酚试剂盒整个提取过程仅需要1.5 h即能完成，避免了长时间的放置，使RNA降解；（2）改良CTAB法提取所用的所有试剂（CTAB提取液、SSTE、LiCl等）均为笔者所在实验室于使用前配置，需要严格灭菌；（3）改良CTAB法提取全程须在冰上操作，但反复的操作可能导致温度不恒定。改良CTAB法提取RNA样品过程中须严格控制低温、快速、无污染这3点，以上因素即可能成为导致本试验中改良CTAB法提取效果差于多糖多酚试剂盒的主要原因。

因此可见，以上5种提取方法中，SDS法提取的样品不合格，Trizol法未见有RNA提出，改良CTAB法、多糖多酚试剂盒法、改良多糖多酚试剂盒法提取的金银花总RNA样品纯度高、完整性好、降解少，基本都能满足RT-PCR、分子克隆、高通量测序、实时定量PCR（q-PCR）等后续试验要求，其中以改良的多糖多酚试剂盒法最佳，该方法能提取到高质量RNA。本研究结果为金银花总RNA提取指明了方向。同时，高纯度的RNA提取也为我们对金银花绿原酸等活性成分合成关键酶基因的相关逆转录过程分析提供了保障，帮助我们了解金银花中活性成分的合成机制，为进一步提高金银花药材中活性成分的积累打下基础。

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