植物细胞壁多糖合成酶系及真菌降解酶系

公维丽 王禄山 张怀强

（山东大学微生物技术国家重点实验室，济南 250100）

植物细胞壁多糖合成酶系及真菌降解酶系

公维丽 王禄山 张怀强

（山东大学微生物技术国家重点实验室，济南 250100）

秸秆类植物细胞壁多糖高效降解转化对我国农业经济的绿色可持续发展具有重要意义，然而植物细胞壁在长期进化过程中形成了复杂结构限制了工业化酶解转化的过程。一方面从植物细胞壁多糖合成酶系的多样性、细胞壁多糖成分的复杂性、超分子结构的异质性等方面综述了形成植物细胞壁抗降解屏障的原因；另一方面从真菌降解植物细胞壁酶系的多样性、不同菌株降解酶组成差异性等分析降解转化植物细胞壁时发挥的不同作用，从而为工业转化合理复配真菌降解酶系，提高秸秆生物质的利用效率提供理论支持。

植物细胞壁；抗降解屏障；多糖合成酶系；真菌降解酶系；绿色可持续发展

进入21世纪，随着我国农耕经济向着机耕经济的转化，农作物秸秆作为农业生产的必然废弃物未得到充分利用，常常就地焚烧等，既浪费了资源，又污染了环境。从化学成分分析，秸秆等生物质可以转化为生物燃料与生物化工产品，相关研究已引起人们的广泛关注。从物质结构角度分析，植物生物质细胞壁结构复杂而致密，形成了防止微生物与酶解的抗降解屏障，利用木质纤维素生产可发酵的糖类，仍未进入大规模生产阶段［1］。

植物细胞壁高效降解生产可发酵的糖类，一方面，需要深入研究植物细胞壁中多糖的合成酶系、合成过程及其形成的超分子结构；另一方面基于超分子结构研究其高效降解所需要的酶类与数量，从而为合理复配高效酶系奠定理论基础。只有深入研究植物细胞壁在长期进化过程形成的“系铃”过程，才能全面了解“解铃”降解过程中所需要的酶系统组成与浓度［2］。只有认识植物细胞壁合成过程中所需要的酶类及其在植物细胞壁合成中发挥的功能，才能全面了解植物细胞壁降解过程中所需酶系及在生物转化优化工艺路线，提高工业应用过程酶解的转化整体效率。

1 植物细胞壁结构及其多糖合成酶系

植物细胞壁主要包括纤维素、半纤维素、果胶、木质素等聚合物，这些聚合物结构复杂，形成微生物和酶分子都很难降解，现在称为“生物质抗降解屏障（Biomass recalcitrance）”［3］。 其中纤维素和基质多糖（半纤维素、果胶）通过不同的路径合成。前者由膜上大的酶复合物合成，酶复合物将微纤丝从细胞膜表面分泌出（图1-A），而基质多糖是由高尔基体中的合成酶合成，并通过囊泡运输与质膜融合后将多糖分泌到胞外（图1-B），这些多糖在物理作用和酶分子催化交联作用下镶嵌到纤维素形成的细胞壁骨架中。

虽然在不同类型细胞壁中，以纤维素作为骨架的细胞壁结构类似，但是细胞壁半纤维素、果胶及木质素等组分在分子结构、种类及含量上具有较大的异质性。纤维素由没有侧链分支的（1，4）-β-D-葡聚糖链通过大量分子间与分子内氢键，以及疏水作用力形成非共价的微纤丝构成［4］，其基本的化学结构在不同植物、器官及组织的细胞壁中是一致的，但纤维素链的长度及结晶度具有较大的异质性。半纤维素（木葡聚糖、甘露聚糖、β-（1，3；1，4）-葡聚糖、木聚糖）和果胶等基质多糖结构更为复杂，不仅具有多种骨架结构，而且还含有丰富的侧链分支，无论是从植物种类、组织层次、细胞发育时期至分子水平上相同聚合物不同局部结构都表现出高度的异质性［5，6］。例如，双子叶植物含有丰富的果胶和木葡聚糖，而在单子叶植物中这两种多糖的含量较低，取而代之的是高含量的木聚糖和（1，3；1，4）- β-D-葡聚糖［7］。

植物细胞壁复杂结构和异质组分与植物基因组中参与细胞壁合成基因的多样性和差异性表达有关［8］。在过去的几十年，模式植物在研究植物细胞壁合成中发挥了重要作用，单子叶植物中的玉米（Zea mays L.）、大麦（Hordeum vulgare L.）、水稻（Oryza sativa L.）及二穗短柄草（Brachypodium distachyon）和双子叶植物中的拟南芥（Arabidopsis thaliana）、棉花（Gossypium spp.）等已获得了测序，据估计大约2 000多种基因的产物参与细胞壁的合成与维持，其中多糖的合成主要是由糖基转移酶（GTs；EC 2.4.x.y）完成。碳水化合物活性酶数据库（CAZy，http：// www.cazy.org/）收录了能够合成或分解复杂碳水化合物和糖复合物的酶类，基于蛋白质结构域中的氨基酸序列相似性，将碳水化合物活性酶类归入不同的家族［9］。目前在CAZy数据库中糖基转移酶分布于97个家族，其中植物的糖基转移酶位于45个家族［10］。仅在拟南芥基因组中参与细胞壁多糖糖苷键合成的351种糖基转移酶就分布于27个家族［11］；且Hansen 等［12］发现一些没有被归类到CAZy家族的可能的糖基转移酶也参与到细胞壁的合成。但是单子叶植物细胞壁合成酶相关基因的研究滞后于双子叶植物，尤其是拟南芥的研究。目前纤维素合成酶系，基质多糖合成酶系及果胶合成酶系的许多进展都是从拟南芥中获得的［13-15］。在本篇综述中，除拟南芥多糖合成酶系研究进展外也包括了一些单子叶植物合成酶系的研究结果。

1.1 纤维素合成酶系

纤维素是由β-1，4糖苷键连接形成无分支的葡聚糖链构成（图1-A纤维素）。纤维素由位于细胞膜上的纤维素合成酶A（CESA）复合物合成，CESA具有糖基转移酶活性且归于GT2家族，在高等植物中，CESA复合物成六角玫瑰花环结构，且每一个玫瑰花环亚基包括6个CESA蛋白，其中的3个CESA蛋白具有不同的结合特性，每个CESA蛋白可以合成一条葡聚糖链，因此CESA复合物一般可以同时合成36条葡聚糖链，并立即组装成一个纤维素微纤丝基本单元［4］，其横截面宽和高大约为5.3 nm× 3.2 nm［16］，在氢键和疏水作用力的作用下微纤丝可以再聚集成更大宏纤丝，但是由于微纤丝具有不同的长度、横截面区及形状，并且可以进行不同程度的弯曲［17］，因此微纤丝中分子链可以以结晶形式堆积，也存在非结晶区形式的堆积。

随着基因组测序数据的增加，以及CESA蛋白突变体的获得，大大增加了人们对CESA蛋白生理生化功能的认识。在拟南芥、水稻及高粱基因组中分别包含10个CESA基因，而玉米基因组中包含20个（http：//cellwall.genomics.prudue.edu/）［13］。基于遗传分析，CESAs分为参与初生细胞壁纤维素合成以及参与次生细胞壁合成的两大类，在拟南芥中AtCESA1、AtCESA3、AtCESA6主要负责初生细胞壁中纤维素的合成，而AtCESA4、AtCESA7、AtCESA8与次生细胞壁纤维素的合成密切相关［18］（表1）。之前研究者猜想次生细胞壁中长度更长且结晶度更高的微纤丝可能是由纤维素酶复合物中CESA组分差异导致的，但是目前的一些研究显示AtCESA1、AtCESA3、AtCESA6在拟南芥的初生壁和次生壁中都有表达［19］，并且与AtCESA6具有较高相似性的AtCESA2、AtCESA5、AtCESA9参与次生细胞壁纤维素的合成，这说明参与初生壁和次生壁纤维素合成的CESAs组分并不是一成不变的。对单子叶植物纤维素合成的研究主要是基于系统发育分析得到的一些结果，直接的实验结果主要有：Juhasz等［20］利用基因突变方法对水稻CesAs基因功能进行研究，其结果显示OsCesA4、OsCesA7、OsCesA9基因突变导致次生细胞壁纤维素含量降低（表1），玉米中的12个CesA基因也得到了克隆表达，其中ZmCESA10、ZmCESA11、ZmCESA12与拟南芥中AtCESA4、AtCESA7、AtCESA8属于同源基因［20，21］。

图1 植物细胞壁多糖合成模式图

纤维素合成主要是由CESA基因编码蛋白参与完成，与此同时，许多非CESA基因编码蛋白（表1，辅助酶）也发挥了不可或缺的作用。在拟南芥中，COBRA（AT5G60920）、 COBL4（AT5G15630）、POM-POM1（AT1G05850）、 KOBITO1（AT3G08550）以及KORRIGAN1（AT5G49720）是研究较为清楚的几种纤维素合成辅助酶，其中COBRA（AT5G60920）蛋白定位于类微管结构蛋白上，在调节微纤丝排列方向中发挥作用，KOBITO1（AT3G08550）蛋白也有类似的功能；COBL4（AT5G15630）是COBRA的同源蛋白主要参与次生细胞壁纤维素的合成；POMPOM1（AT1G05850）是一种类似于几丁质酶的蛋白，可能通过蛋白与纤维素的相互作用影响纤维素的合成；而KORRIGAN1（AT5G49720）蛋白不仅可能去除纤维素合成起始引物，而且可去除葡萄糖链合成过程出现错误的葡聚糖链，同时，微纤丝的合成终止也可能由这一蛋白参与完成［22］。

随着对纤维素合成过程及其酶系认识的增加，人们逐渐可以通过改变纤维素合成酶来提高生物燃料产率，DeBolt通过对拟南芥中AtCESA1、AtCESA3蛋白C末端跨膜结构域的突变来降低纤维素微纤丝的结晶度从而提高糖化率［23］。但是目前还有许多重要的问题悬而未决，如CSC玫瑰花样的TC复合物如何组装、纤维素合成起始是否需要引物、微纤丝合成后如何聚集成束，以及纤维素的结晶程度受何种因素控制等相关问题的解决需要细胞生物学、生物化学、生物物理学和计算建模等领域的共同努力。

1.2 半纤维素合成酶系

半纤维素的化学组成主要包括（半乳）甘露聚糖、木葡聚糖、木聚糖、及β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖等结构类型，与纤维素不同，半纤维素不仅具有多样的骨架结构，而且还有复杂的侧链分支。因此参与半纤维素合成的酶系比纤维素合成酶系更为复杂，不但包括骨架合成酶而且还有大量的侧链转移酶，并且这些酶类不是位于细胞膜上而是位于高尔基体中，因此半纤维素的合成是在高尔基体上完成的（图1-B）。

表1 拟南芥、水稻及玉米中已鉴定的参与纤维素合成的纤维素合成酶和辅助酶组分

（半乳）甘露聚糖、木葡聚糖和木聚糖骨架分别由甘露糖残基、葡萄糖残基和木糖残基通过β-1，4糖苷键连接而成（图1-C）。与这3种半纤维素类型不同，β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖骨架是通过β-1，4-和β-1，3-糖苷键连接葡萄糖残基形成，并且β-1，4-糖苷键可以2个或3个连续存在，但没有连续的β-1，3-糖苷键，因此β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖可以看作纤维三糖和纤维四糖通过β-1，3-糖苷键连接而成的葡聚糖。

类纤维素合成酶基因（Cellulose synthases-like genes，Csls）编码的多糖合成酶（类纤维素合成酶）参与半纤维素骨架合成，Csls与CesA基因具有很高的相似性，目前，9个类纤维素合成酶（Csl）基因（CslA-H 和J）家族和1个纤维素合成酶（CesA）基因家族构成了纤维素合成酶基因超家族（表2），并且CslF、CslH只在禾本科植物中检测到，而CslB和CslG是非禾本科植物所独有的。类纤维素合成酶和纤维素合成酶一样位于GT2家族，是含有多个跨高尔基体膜结构域（Transmembrane domains，TMDs）的完整膜蛋白。对纤维素合成酶功能的研究主要采用基因突变的方法，但是由于类纤维素合成酶基因在不同物种中存在差异，因此这一方法对研究类纤维素合成酶功能并不适合，对类纤维素合成酶功能的认识主要通过异源表达等方法获得。

CslA基因家族的多个基因编码（半乳）甘露聚糖骨架合成酶（ManS），在双子叶植物拟南芥和杨树（Populus trichocarpa） 中，AtCSLA2、AtCSLA3、AtCSLA7、AtCSLA9和PtCSLA1的β-甘露聚糖合成酶活性已经在体外得到了验证。同时，在单子叶植物魔芋（Amorphophallus konjac）中，异源表达实验结果显示，CslA3的直系同源蛋白AkCSLA3可以同时利用GDP-甘露糖和GDP-葡萄糖来合成甘露聚糖。除CslA之外，CSLD 蛋白（AtCSLD2，3和 5）及MSR基因编码蛋白也可能参与到甘露聚糖骨架的合成［24］。木葡聚糖骨架合成是由CslC 基因家族的一个或多个基因参与，研究者对旱金莲（Tropaeolum majus）种子进行转录组分析得出TmCSLC4基因与木葡聚糖合成相关，对其异源表达发现只有与木葡聚糖木糖基转移酶（XyG∶XylT）共表达时才可以合成β-1，4-葡聚糖，但这一过程并不需要UDP-木糖基的存在，因此XyG∶XylT蛋白是木葡聚糖骨架合成所必需［25］。通过比较基因组学分析，Burton等［26］发现CslH和CslF 是禾本科植物所独有的CSL基因家族，由此推测CslH和CslF在β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖合成中可能发挥功能，并采用转基因等方法对他们的推测进行了验证。但是这些蛋白具体是参与β-1，4-键还是β-1，3-键的合成，目前研究得还不清楚。与上述3种半纤维素类型不同，目前没有试验证据显示CSL蛋白在木聚糖骨架合成中发挥作用，而IRX9（GT43）、IRX14（GT43）及 IRX10（GT47）等其他GT家族的GT酶被认为代替它们发挥功能，但是对木聚糖骨架合成机制的认识还远远不够。

除β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖没有侧链以外，（半乳）甘露聚糖、木葡聚糖和木聚糖都具有短的糖链、乙酰基或酚醛基团等侧链分支。多种多样的糖基转移酶（GlyTs）负责将这些不同的侧链基团添加到多糖骨架上［27］。

（半乳）甘露聚糖取代基包括α-1，6-半乳糖残基和O-乙酰基。α-1，6-半乳糖基转移酶最早是在胡芦巴（Trigonella foenum-graecum）中得到鉴定，也是第一个纯酶活性得到验证的参与植物细胞壁合成的GT酶［24］，O-乙酰基的添加可能是由TBL（Trichome birefringence-like）蛋白家族的O-乙酰基转移酶参与完成，TBL 基因家族是植物所特有的O-乙酰基转移酶基因家族（表2，乙酰基转移酶），甘露聚糖、木葡聚糖的O-乙酰化都需要这一基因家族编码蛋白参与［28］。

木葡聚糖侧链基本基团有：D-木糖残基、D-半乳糖残基和L-岩藻糖基，在双子叶植物和非禾本科单子叶植物中木葡聚糖具有规则的取代模式，每4个骨架葡萄糖残基中的连续3个通过α-1，6糖苷键与木糖残基相连，第2和第3个木糖残基可以被半乳糖通过β-1，2糖苷键取代，而第2个半乳糖残基还可以进一步被岩藻糖基通过α-1，2糖苷键取代。几种木葡聚糖木糖基转移酶已经得到了鉴定，在拟南芥中，7个基因编码蛋白位于GH34家族，其中5个具有木葡聚糖木糖基转移酶活性，但是目前还不清楚木葡聚糖中木糖残基取代模式的形成机制。第2和第3位木糖半乳糖基分别由AtMUR3 和AtXLT2添加，这两个蛋白是位于GH47家族的β-1，2 半乳糖基转移酶。第2位半乳糖残基上岩藻糖基的进一步取代是由GT37家族的木葡聚糖α -1，2岩藻糖基转移酶（AtFUT1）参与完成，fut1/mur2的突变导致拟南芥中木葡聚糖的完全去岩藻糖基化，说明AtFUT1是非冗余蛋白［29］。除了规则的糖基取代模式之外，在不同植物类型中木葡聚糖的不同位置可以被乙酰基取代，在拟南芥中O-乙酰化可以特定地发生在半乳糖残基，由TBL家族的AtAXY4编码蛋白介导；而在禾本科植物和茄目物种中，木葡聚糖骨架中的葡萄糖残基可以被O-乙酰化，但是，目前负责这一修饰的特定基因还没有得到鉴定［24］。与此同时，一些实验表明几种XyG修饰蛋白包括内切转糖基酶/水解酶（XTHs）对改变木葡聚糖长度，将其镶嵌到细胞壁中，或者是在细胞伸长过程中重塑细胞壁网络结构具有重要作用［30］。

木聚糖侧链取代基在不同物种及组织中存在较大差异，通常木聚糖骨架可以被葡萄糖醛酸（GlcA）和4-O-甲基葡萄糖醛酸（MeGlcA）通过α-1，2糖苷键取代，同时O-乙酰基团也可以通过酯键与骨架相连。在单子叶植物中，除了上面的取代基团之外，大量的阿拉伯呋喃糖基（Araf）可以通过α-1，3或/和α-1，2-糖苷键与骨架相连。此外，阿拉伯呋喃糖还可以与阿魏酸或香豆酸形成酯键从而与木素相互交连。近年来，虽然对木聚糖骨架合成研究取得的进展较小，但对木聚糖取代基合成研究进展较大。在拟南芥中，AtGUX1 和AtGUX2负责将葡萄糖醛酸残基添加到木聚糖骨架上，对多种gux突变体及相应回补菌株研究表明GUX蛋白的多样性决定了木聚糖中不同的葡萄糖醛酸取代模式［31］。拟南芥中葡萄糖醛酸的进一步取代与一种木聚糖甲基转移酶（GXMT/GMX3）相关，GXMT/GMX3突变导致葡萄糖醛酸的甲基取代减少75%［24］。在水稻中，GT61家族的OsXAX1参与木聚糖β-木糖-1-2-α-阿拉伯糖侧链中木糖基的添加，同时，OsXAX1突变植物中阿魏酸和香豆酸等组分缺少，但是具体作用机制还不明确［32］。同属于GT61家族的XATs与木聚糖中阿拉伯呋喃糖残基侧链形成具有密切关系，Anders等［33］对小麦胚乳中的TaXAT1和TaXAT261敲除后木聚糖α-1，3-连接的阿拉伯取代基减少，而回补后恢复取代水平。

虽然利用功能基因组学的方法已经对多种参与半纤维素合成酶进行了鉴定，但是对半纤维素合成酶系的深入研究也面临许多挑战。例如，这些酶类的晶体结构、酶活性及底物特异性怎样，以及它们在时间和空间尺度上是怎样相互合作来高效有序的合成这些复杂结构的多糖。随着比较基因组学，标记代谢组学等技术的快速发展，这些问题将逐渐被解决。

1.3 果胶合成酶系

果胶是植物细胞壁中结构最复杂的多糖，其含量约占禾本科植物细胞壁的2%-10%，占双子叶植物和非禾本科单子叶植物初生细胞壁的35%，主要包括聚半乳糖醛酸（HG）、木糖聚半乳糖醛酸（XG）、鼠李聚半乳糖醛酸 Ⅰ（RG Ⅰ）和鼠李聚半乳糖醛酸Ⅱ（RG Ⅱ）4种结构类型（图1-A果胶）［2］，其中HG是由半乳糖醛酸通过α-1，4糖苷键形成的聚糖，高达80% 半乳糖醛酸的羧基可以被甲基酯化，其O-2 或O-3位置还可被乙酰化，一些半乳糖醛酸的O-3位置可以被β-D-木糖取代形成木糖聚半乳糖醛酸（XG），RG Ⅱ也是聚半乳糖醛酸（HG）的进一步取代形式，并有4种不同类型的侧链。与以上3种果胶类型不同，RG Ⅰ骨架是由重复的［4）-α-D-半乳糖醛酸-（1，2）-α-L-鼠李糖-（1，］n聚合而成，其侧链包括α-1，5-L-阿拉伯聚糖、β-1，4-D-半乳聚糖和β-1，6-D-半乳聚糖，果胶的合成至少需要67种糖基转移酶参与完成［34］。

目前研究果胶合成转移酶及其编码基因的进展缓慢，主要是由于很难获得有活性的纯果胶合成酶，只有少数果胶合成酶酶活性得到生化验证（表3），另外还有一些基因可能参与到果胶的合成，主要包括参与HG、XG和RGⅠ骨架合成的HG半乳糖醛酸转移酶，以及与侧链添加相关的HG甲基转移酶、RGⅠα-1，5-阿拉伯糖基转移酶、RGⅠβ-1，4-半乳糖基转移酶、RG Ⅱα-1，3-木糖基转移酶和XGα-1，3-木糖基转移酶。通过免疫共沉淀方法研究发现GAUT1和GAUT7形成HG∶GalAT复合物参与果胶合成，且GAUT1∶GAUT7是HG∶GalAT的核心组分，与这一复合物相互作用的12个蛋白也可能在果胶合成中发挥作用［35］。这一多糖合成复合物的发现为理解植物细胞壁糖基转移酶复合物的组装及其在复杂多糖合成中如何发挥作用提供了参考，同时也增加人们对GTs及多糖修饰酶多样性的认识。

果胶合成酶位于高尔基体中，与半纤维素一样，果胶的合成也是在高尔基体中完成。关于果胶合成有两个假设模型，（1）连续的糖基转移酶模型（Consecutive glycosyltransferase model）；（2）结构域合成模型（Domain synthesis model），这两个模型在果胶合成酶添加果胶结构单元方式上存在差异，但认为两者果胶骨架的延伸和修饰侧链添加都是在高尔基体中完成，通过囊泡运输释放到胞外，从而与细胞壁骨架相互交联。

表2 已鉴定的参与半纤维素骨架和侧链合成的半纤维素合成酶

2 植物细胞壁多糖真菌降解酶系

植物细胞壁中多糖合成酶系合成结构复杂的多糖，形成了抵抗微生物及相关酶系降解的“抗降解屏障”。同样，微生物在与植物共同进化过程中也形成了许多降解细胞壁的策略［6］。尤其是真菌通过分泌大量的游离酶系在降解植物生物质中发挥了重要作用，随着越来越多真菌基因组数据的获得，人们对真菌降解植物细胞壁的生物多样性也有了更为深入的认识，在进化过程中由于不同真菌生存环境存在差异，因此其降解酶种类及数量也各不相同。例如，瑞氏木霉（Trichoderma reesei）具有更加高效的纤维素降解酶系，曲霉属（Aspergillus sp.）部分物种分泌更多的降解果胶酶系，而草酸青霉（Penicillium oxalicum）具有更多数量的纤维素酶和半纤维素酶系（表4）［13，36，37］。

碳水化合物活性酶数据库（CAZy）不仅包含不同GT家族的参与植物细胞壁多糖合成的糖基转移酶，而且包含不同家族的降解多糖的糖苷水解酶（Glycoside hydrolases，GH）。参与植物细胞壁降解的真菌酶类被归入糖苷水解酶（GHs）家族、碳水化合物酯酶（Carbohydrateesterases，CEs）家族、多糖裂解酶（Polysaccharide lyases，PLs）家族和辅助酶类（Auxiliary activities，AAs）家族，这些不同家族的降解酶协同对纤维素、半纤维素及果胶等多糖降解。

表3 拟南芥基因组中已经验证与预测的果胶合成酶基因

2.1 纤维素降解酶系

虽然纤维素只有一种结构单元和一种键型，但是其形态具有结晶区和非晶区的差异。降解纤维素的丝状真菌通常分泌3种典型酶类［38］：β-1，4-内切葡聚糖酶（EGL，EC 3.2.1.4）、外切葡聚糖酶/纤维二糖水解酶（CBH，EC 3.2.1.91；EC3.2.1.176）以及β-葡萄糖苷酶（BGL，EC 3.2.1.21）［39］，内切葡聚糖酶从无定型区内部水解纤维素链的糖苷键，产生的葡聚糖链可以进一步被外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶降解，外切纤维素酶对结晶区的降解具有重要作用，可以从纤维素链还原端（CBH I，EC 3.2.1.176）或非还原端（CBH Ⅱ，EC 3.2.1.91）持续降解产生纤维二糖，纤维二糖可以进一步被β-葡萄糖苷酶降解为葡萄糖，这对解除外切纤维素酶的产物抑制起着不可或缺的作用。

内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶具有大量的同工酶，并且分布于不同的家族，真菌内切葡聚糖酶主要位于GH5、GH7、GH12、GH45等家族，外切葡聚糖酶主要分布于GH6、GH7家族，而β-葡萄糖苷酶的主要家族有GH1、GH3家族［40］。虽然大部分降解木质纤维素的丝状真菌都可以分泌这三种酶类，但同工酶的数量及分布的家族存在明显差异。例如，黑曲霉具有7个EGLs分别位于GH5 和GH12家族中，6个CBHs分布于GH6和GH7家族，以及15个BGLs位于GH1和GH3家族，比较而言，降解纤维素最为高效的真菌之一——瑞氏木霉，具有7个EGLs，分布于GH5、GH7、GH12及GH45家族，2个高效表达的CBHs位于GH6和GH7家族，以及11个位于GH1和GH3家族的BGLs。研究显示，GH5、GH6、GH7、GH9、GH12及GH45家族的内切葡聚糖酶同工酶的底物专一性存在差异［41］。利用荧光辅助糖电泳对瑞氏木霉等产的4个内切纤维素酶作用模式研究表明，它们结合的糖链聚合度存在差异，产物谱也各不相同［42］。因此纤维素酶功能还需要进一步细化，如EGL不是

简单的作用于无定型区，而应是对特定长度的寡糖有专一性。

表4 瑞氏木霉、黑曲霉、草酸青霉基因组中纤维素酶、半纤维素酶及果胶酶基因数量统计

表4 （续）瑞氏木霉、黑曲霉、草酸青霉基因组中纤维素酶、半纤维素酶及果胶酶基因数量统计

除了经典类型的纤维素降解酶之外，最近研究发现，大量的辅助酶类也参与到纤维素的降解［38］。多糖单氧化物酶（PMOs）是铜离子依赖酶，属于AA9家族，可以接受纤维二糖脱氢酶（Cellobiose dehydrogenases，CDHs）氧化纤维二糖提供的电子对纤维素氧化降解，PMOs作用于纤维素表面而无需从结晶纤维素中解离出单根葡聚糖链。在粗糙脉胞菌中，敲除一个纤维二糖脱氢酶基因就可以使其总纤维素酶酶活降低一半，这说明氧化还原系统是纤维素降解机制中非常重要的部分［43］。不同丝状真菌之间PMOs编码基因的数量具有很大差异，粪壳菌纲的一些种类，如球毛壳菌、粗糙脉胞菌等，PMOs编码基因的数量明显高于黑曲霉和瑞氏木霉［16］。与此同时，丝状真菌基因组编码和表达大量的PMOs同工酶，类似于内切纤维素酶同工酶，这些PMOs同工酶可能在纤维素的精细结构中具有不同的作用位点［16，44］。Swollenin是与植物扩展蛋白（Expansins）具有序列同源性的一种蛋白（图2-A），最早是在瑞氏木霉中鉴定和表达，在纤维素酶中添加Swollenin蛋白后可以显著提高纤维素酶降解滤纸的效率［45］。目前认为Swollenin作用机制是影响微纤丝的超微结构，使微纤丝之间的空隙变大，增加纤维素酶对微纤丝中葡聚糖链的可及性，而不是直接断裂微纤丝产生可检测的葡聚糖链还原端。Cip1（Cellulose induced protein-1）和Cip2（Cellulose induced protein-2）蛋白最早是在瑞氏木霉转录分析中检测到，两者都包含一个碳水化合物结合模块（CBM）并与已知的纤维素酶共调控［46］，瑞氏木霉Cip1对p-硝基苯-β-D-纤维二糖苷具有微弱的降解活性，并可以与PMO及Swollenin协同作用，但是其具体作用机制还是未知的［38］，Cip2具有酯酶活性，可以断裂4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸的甲酯键［16］。在植物细胞壁的降解中纤维素底物的暴露是一个重要的环节，辅助蛋白可以显著提高这一环节的效率［47］。因此，在工业应用中对这些辅助蛋白功能的深入研究是十分必要的。

2.2 半纤维素降解酶系

在半纤维素合成的论述中已提到，它具有复杂的骨架结构和侧链分支，所以对它的降解不仅需要骨架降解酶，而且还需要大量的侧链降解酶。

木聚糖骨架是由β-1，4-内切木聚糖酶（EC 3.2.1.8）和β-1，4-木糖苷酶（EC 3.2.1.37）降解（图2-D），真菌分泌的β-1，4-内切木聚糖酶主要位于GH10和GH11家族［48］，通常GH10家族的木聚糖酶比GH11家族的酶组分具有更广泛的底物专一性，它不仅可以降解线性的木聚糖链，而且可以降解高度取代基的木聚糖骨架和木寡糖，因此GH10家族的木聚糖酶对于含有取代基的木聚糖降解更彻底［40］。内切木聚糖酶降解产生的木寡糖可以被β-木糖苷酶进一步降解，大多数真菌的β-木糖苷酶位于GH3家族，但是一些真菌的β-木糖苷酶位于GH43家族，如米曲霉［49］。

真菌分泌的降解木葡聚糖骨架的木葡聚糖β-1，4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.151）（图2-B）主要位于GH12和GH74家族，这两个家族的酶具有不同的作用模式。黑曲霉GH12家族的木葡聚糖β-1，4-葡聚糖酶不能断裂含有取代基的葡萄糖苷键，并且更倾向于降解至少包含6个葡萄糖残基的木葡寡糖，且其中至少有一个葡萄糖残基未被取代；而瑞氏木霉GH74家族的木葡聚糖酶可以降解更短的木葡寡糖，降解活性也不受取代基的影响［50］，因此GH74家族的β-1，4-葡聚糖酶可以对木葡聚糖骨架进行更为有效的降解。

降解甘露聚糖骨架的内切甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）（图2-E）属于GH5和GH26家族。真菌的内切甘露聚糖酶主要位于GH5家族，并且研究显示，黑曲霉和瑞氏木霉GH5家族的内切甘露聚糖酶都具有底物专一性，都只能降解含有3个以上D-甘露糖残基的甘露寡糖［51］；内切甘露聚糖酶产生的甘露二糖或甘露三糖可以进一步被GH2家族的β-1，4-甘露糖苷酶（EC 3.2.1.23）降解，因此甘露糖苷酶对甘露聚糖骨架彻底降解为甘露糖结构单元起着重要作用。

β-（1，3；1，4）-D-葡聚糖虽然同纤维素一样都是由β-D-葡萄糖构成，但是由于两者合成酶合成键型的差异，所以在降解过程中除了降解纤维素的β-1，4-葡聚糖酶（纤维素酶EC 3.2.1.4）之外，还需要另外3种类型的酶组分：β-1，3-1，4-葡聚糖酶（地衣聚糖酶，EC 3.2.1.73）、 β-1，3-葡聚糖酶（海带多糖酶，EC 3.2.1.39）和 β-1，3（4）-葡聚糖酶（EC 3.2.1.6），它们主要位于GH16、GH17、GH55、GH64、GH71、GH81家族中［52，53］。

半纤维素侧链完全降解需要至少9种活性酶的作用，这些酶位于至少11个GH家族和4个CE家族，酶种类主要包括α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-木糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、p-香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶［40］。

L-阿拉伯糖是木葡聚糖和（阿拉伯）木聚糖中常见的取代基，可以被α-阿拉伯呋喃糖苷酶（Abf）（EC 3.2.1.55）和阿拉伯木聚糖-阿拉伯呋喃糖苷酶（图2-B，2-D）从木葡聚糖和（阿拉伯）木聚糖中降解出来，真菌的α-阿拉伯呋喃糖苷酶主要位于GH51和GH54家族，对黑曲霉两个分别位于GH51和GH54家族的α-阿拉伯呋喃糖苷酶底物专一性研究显示，AbfA（GH51）可以降解阿拉伯聚糖而AbfB（GH54）具有碳水化合物结合模块（CBM 42）还可以特定的降解半纤维素中的阿拉伯呋喃糖取代基。

与木葡聚糖骨架通过α-糖苷键连接的D-木糖残基的可以被α-木糖苷酶（EC 3.2.1.177）降解，曲霉基因组分析数据显示，α-木糖苷酶降解位于GH31家族，这已通过在毕赤酵母中过表达得到验证［54］。

L-岩藻糖苷基是木葡聚糖的主要取代基，可以被位于GH29和GH95家族的α-岩藻糖苷酶（EC 3.2.1.51）降解，许多植物的α-岩藻糖苷酶可以降解木葡聚糖岩藻糖侧链，但在真菌中，只有黑曲霉（A. niger）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和多色青霉（Penicillium multicolor）分泌的α-岩藻糖苷酶可以降解木葡聚糖中的岩藻糖苷基［40］。

在木聚糖和半乳甘露聚糖中，D-半乳糖苷基可通过α-糖苷键与骨架相连，α-半乳糖苷基可被GH27和 GH36家族的α-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.22）（图2-D，2-E）降解，这两个家族的α-半乳糖苷酶都采用双交换机制，并具有共同的进化起源，通常GH36家族的α-半乳糖苷酶分子量更大且对单糖和寡糖都具有降解作用［55］。在木葡聚糖和半乳葡甘露聚糖中，D-半乳糖苷基还可通过β-糖苷键连接到骨架上，这说明β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.25）（GH2 和 GH35）在降解含有β-半乳糖残侧链的半纤维素中具有重要作用（图2-B，2-E），研究结果也证明了这一点，将黑曲霉的β-半乳糖苷酶（LacA）添加到酶复合物中可以显著提高小麦粉中D-半乳糖基的释放［56］。

D-葡萄糖醛酸残基是木聚糖的侧链结构，由位于GH67家族和新鉴定的GH115家族α-葡萄糖醛酸酶（EC 3.2.1.131）降解，两个家族的酶在底物专一性上存在明显差异，GH67家族的酶对寡糖具有降解活性而GH115家族的酶对木聚糖聚合物的降解起作用。Chong等的研究显示，GH67家族α-葡萄糖醛酸酶广泛分布于子囊菌分泌酶系中，而GH115家族的酶既存在于子囊菌，也存在于担子菌中［40］。

乙酰基是木聚糖的常见取代基，它是由CE1、 CE4、CE5和CE16家族的乙酰木聚糖酯酶降解，乙酰木聚糖酯酶的存在对内切木聚糖酶有效降解木聚糖骨架具有重要作用，如只有当乙酰木聚糖酯酶存在时，黑曲霉的3个内切木聚糖酶和β-木糖苷酶才可有效降解桦木木聚糖［57］。

阿魏酸和p-香豆酸对木聚糖和木素的交联具有重要作用，可以被阿魏酸酯酶/香豆酸酯酶移除，但是这些酯酶大部分还没有被归类到相应的CE家族。

2.3 果胶降解酶系

在果胶的4种类型中，聚半乳糖醛酸（HG）、木糖聚半乳糖醛酸（XG）和鼠李聚半乳糖醛酸Ⅱ（RGⅡ）具有相同的骨架结构，鼠李聚半乳糖醛酸 Ⅰ（RGⅠ）骨架与前3者存在差异，四者具有甲基、乙酰基和糖链等不同的取代基团。

对果胶骨架降解的真菌降解酶主要分为两种类型：糖苷水解酶和果胶裂解酶（PLs）（图2-F）。糖苷水解酶主要位于GH28家族，根据它们作用果胶骨架部位的不同分为内切聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.15）、外切聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.67）、内切鼠李聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.171）、外切鼠李聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.173）、木糖聚半乳糖醛酸酶（EC 3.2.1.-）和α-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40），同时GH88家族的不饱和葡萄糖醛酸水解酶（EC 3.2.1.-）和GH105家族的不饱和鼠李半乳糖醛酸水解酶（EC 3.2.1.172）也参与果胶骨架的降解。果胶裂解酶和果胶酸裂解酶都采用β-消除机制断裂果胶中没有取代基部分的α-1，4-糖苷键，果胶裂解酶主要位于PL1家族，果胶酸裂解酶在PL1、PL3和 PL9家族都有分布，鼠李半乳糖醛酸裂解酶与果胶裂解酶和果胶酸裂解酶结构上存在差异，作用底物部位也不同，它可降解果胶骨架中含有取代基的部分。

降解果胶骨架的糖苷水解酶和裂解酶也具有大量的同工酶。研究发现，黑曲霉基因组的7个内切聚半乳糖醛酸酶分别表现出不同的动力学特性、甲基敏感性和作用模式［37］，米曲霉的15个半乳糖醛酸酶对聚半乳糖醛酸表现出不同的底物特异性［58］，同工酶的不同作用特点说明了对于多糖的降解需要大量同工酶的共同作用。

图2 真菌基因组中降解纤维素、半纤维素和果胶相关酶类

木糖聚半乳糖醛酸和鼠李聚半乳糖醛酸侧链的去除还需要侧链降解酶的作用，丝状真菌分泌的α-阿拉伯呋喃糖苷酶（GH51和 GH54）、β-半乳糖苷酶（GH2 和 GH35）和β-木糖苷酶（GH3和GH43）不仅对半纤维素侧链起作用，而且在果胶侧链去除中也发挥功能。此外，内切阿拉伯聚糖酶（GH43），外切阿拉伯聚糖酶（GH93），β-内切半乳聚糖酶（GH53）和几种酯酶（CE8、 CE12及 CE13）只对果胶侧链进行降解。

3 展望

植物基因组测序数据显示了植物基因组中含有大量的糖基转移酶，仅在拟南芥基因组中就有351种，由于糖基转移酶的作用特异性使得每种糖基转移酶对应着一种糖苷键，由此推测植物细胞壁中有几百种糖苷键类型［59］，因此将这些糖苷键断裂实现单糖的有效释放也相应的需要多种糖苷水解酶的作用。丝状真菌虽然是降解植物细胞壁多糖的主要类群，但是对已测序的丝状真菌基因组同源注释分析表明，单一丝状真菌基因组中糖苷水解酶的数量要远少于植物细胞壁糖苷键类型［19］，所以单一一种丝状真菌并不能将复杂的天然生物质（Natural biomass）彻底有效的降解，必须依靠多种微生物的协同作用。丝状真菌糖苷水解酶基因注释提供了一定的丝状真菌降解酶种类的信息，但只有少量的糖苷水解酶功能得到了生化功能验证，大量糖苷水解酶的生化功能验证将不仅有助于真菌基因组更好的注释，而且为植物细胞壁多糖的有效降解提供更多具有明确、精细降解功能的酶资源。研究需通过转录组技术、蛋白质组技术及结构生物信息学技术等进行高通量的功能分析与实验验证。

植物基因组中糖基转移酶基因的表达在不同植株、不同组织以及细胞的不同生长周期都存在显著差异，合成的多糖种类、结构及含量也具有明显异质性（Heterogeneity）［60］。而丝状真菌主要为腐生真菌或植物病原菌，在与植物共同进化过程中形成了降解特定类型多糖的降解酶系，对于不同的多糖具有各自的降解优势和偏好性。King等［7］对156种真菌的降解酶谱分析发现，以单子叶植物作为宿主的植物病原菌对于单子叶植物的半纤维素和细胞壁类型具有更高的降解能力，而双子叶植物病原菌更倾向于降解双子叶植物的木葡聚糖等半纤维素。对丝状真菌降解天然生物质偏好性的研究，将会为寻找降解特定底物的优势降解酶系，根据底物类型复配降解酶系提供指导，从而为工业转化合理复配微生物降解区系，提高秸秆生物质的利用效率提供理论支持。

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Diverse Synthetases and Fungi Degradation Enzymes for the Polysaccharides of Plant Cell Walls

Gong Weili Wang Lushan Zhang Huaiqiang
（The State Key Laboratory of Microbial Technology，Shandong University，Ji’nan 250100）

Efficient degradation and conversion of the polysaccharides in the plant cell wall of straw is of great significance for green and sustainable development of agriculture economy in China. But the enzymatic hydrolysis process of the polysaccharides was restricted by the complex structures of plant cell wallsformed in the long-term evolution process. In this paper, the diversity of plant cell wall polysaccharides synthetases, the complexity of cell wall polysaccharides, and the heterogeneity of supramolecular structures are reviewed from the perspective of the reasons causing plant cell wall recalcitrance；in addition, the variety of plant cell wall degradation enzymes of fungi, and the discrepancy among different strains in degrading different biomass were also summarized, which provide theoretical support for reasonable recompounding of fungi degradation enzymes in industrial to improve the utilization efficiency of straw biomass.

plant cell wall；recalcitrance；polysaccharides synthetases；fungi degradation enzymes；green and sustainable development

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.014

2015-03-06

国家“ 973”计划（2011CB707401），国家自然科学基金项目（31370111，31170071），山东省自然科学基金项目（ZR2013CM038）

公维丽，女，博士，研究方向：微生物生理生化；E-mail：15264110812@163.com

张怀强，男，博士，研究方向：微生物生理生化；zhq@sdu.edu.cn