猪多能性干细胞研究进展与前瞻

薛冰华 刘忠华

（东北农业大学胚胎工程实验室，哈尔滨 150030）

猪多能性干细胞研究进展与前瞻

薛冰华 刘忠华

（东北农业大学胚胎工程实验室，哈尔滨 150030）

多能干细胞具有能够分化为多种特定细胞类型的能力，主要包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和诱导多能干细胞。猪因其在免疫学、形态学和生理结构上与人有着诸多类似的特点，正逐渐成为人类异种移植、细胞治疗和再生医学研究的理想生物学模型。然而，目前对猪多能干细胞的来源、特征及机制认识的不足直接阻碍了该研究领域的发展。因此，将对猪多能性干细胞的种类、鉴定标准、研究进展、亟待解决的问题进行详细地阐述，并在此基础上对猪多能性干细胞的研究进行了展望，希望为该研究领域的科研人员提供参考。

猪；多能干细胞；胚胎干细胞；诱导多能干细胞；胚胎生殖细胞

干细胞是一类能够自我更新，功能还未特化的细胞群，在特定的条件下，该类细胞可以分化为执行机体特殊功能的效应细胞，它们广泛存在于机体生长发育过程中的多数组织和器官中。这些特性使得干细胞被广泛应用于临床疾病治疗中，它可以为细胞治疗和再生医学提供种子细胞；其次，由于药物筛选和安全检验不能直接以人为试验对象，所以干细胞也是药物研究的理想模型；最后，干细胞也在基础研究、物种繁育等方面有着独特的应用前景和优越性。然而，由于伦理道德、免疫排斥和生物安全性等问题，人的干细胞无法直接应用于临床治疗，这就要求科研工作者必需寻找合适的动物来代替人进行临床前研究。

猪在免疫学、形态学和生理结构上与人有着诸多类似的特点，饲养和繁殖也较为简单，因此被作为动物疾病模型广泛地应用于人类疾病的临床研究中。同时，猪作为大型家畜在畜牧业生产上有着举足轻重的地位，这都使得猪的干细胞、特别是多能干细胞的建立尤为重要。然而，由于诸多因素的限制，猪多能性干细胞的建立虽然取得了较大的进展，但仍然面临着建系难度大、成功率较低、多能性较差和分化能力弱等诸多问题，很多技术和理论问题也仍需要进一步探索，如猪多能性干细胞最适的培养体系、维持多能性的调控机制以及影响其获得核移植和嵌合体动物的机理等。因此，本文将对猪多能性干细胞的分类、鉴定标准、研究进展、目前存在的问题及可能的解决办法进行详细论述。

1 多能性干细胞的定义和分类

来源于不同发育阶段和不同组织器官的干细胞在基因表达调控、表观遗传状态、体外增殖和分化潜能等方面都存在较大的差异。根据干细胞增殖能力和分化潜能的不同，可以把干细胞分为全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞是指除了能够发育出构成机体的3个胚层的各类细胞外，还能发育出支持胎儿在母体存在所必需的胎盘组织和脐带，最原始的全能干细胞就是哺乳动物精子和卵子结合后形成的受精卵，它在前几个分裂过程中产生的卵裂球均为全能干细胞，提取这些卵裂球中的任意一个移植到子宫，均可发育出一个完整的生命体。多能干细胞是指能够无限增殖且具有分化潜能的一类干细胞，它能够产生内胚层、中胚层和外胚层来源的各种类型细胞，多能干细胞主要包括来源于囊胚内细胞团的胚胎干细胞、来源于原始生殖细胞的胚胎生殖细胞、来源于畸胎癌的胚胎肿瘤细胞和体外重编程得到的诱导多能性干细胞。专能干细胞是指只能分化为一种或密切相关的几种类型的细胞的干细胞，主要包括造血干细胞、骨髓间充质干细胞和表皮干细胞在内的各类成体干细胞［1］。

胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和诱导多能性干细胞这三种干细胞在生物学特性、免疫学、多能性和发育潜能等方面拥有相似的特征，均具有形成生殖系嵌合体的能力，这使得多能性干细胞在基础研究领域（包括基因功能研究、细胞分化和机体发育机制的研究等）、临床治疗（包括药物研发和再生医学领域的研究等）和动物生产方面（包括核移植、嵌合体和转基因动物的生产与研究等）具有独特的应用前景和优越性。因此，后文将重点论述这三种多能性干细胞在猪中的研究现状。

胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）最早是在1981年由Evans［2］和Martin［3］两家实验室首次从植入前的小鼠囊胚内细胞团中分离培养获得，其后对其它物种相继建立了ESCs。Thomson等［4，5］在1995年和1998年分别建立了第一株非人灵长类的ESCs和人的ESCs，所获得的ESCs可在免疫缺陷鼠体内形成畸胎瘤。Li等［6-8］三家实验室在2008年同时宣布他们通过使用大鼠源的Lif（Leukemia inhibitory factor）、添加小分子抑制GSK3和MEK途径以及使用一种来源于成年大鼠皮下连接组织的L细胞系作为饲养层可高效而稳定的得到大鼠ESCs。在各物种ESCs建立的同时，胚胎生殖细胞和诱导多能性干细胞也随着ESCs培养条件的成熟逐渐被建立起来。胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells，EGCs）最早是在1992年由Resnick等［9］和Matsui等［10］通过体外培养小鼠的原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）分离得到的，该细胞系有着与小鼠胚胎干细胞类似的生物学特性，其多能性及生殖系嵌合能力后被Stewart等［11］证实。诱导多能性干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）最早是在2006年由Takahashi 和Yamanaka［12］首次将4个与多能性相关的基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）利用逆转录病毒载体导入到小鼠成纤维细胞中，通过筛选Fbx15（多能性标志分子）阳性的细胞最终获得的具有小鼠胚胎干细胞某些特性的多能性干细胞系，Yamanaka将其命名为“诱导性多能干细胞”（图1）。iPSCs技术的诞生深化了人们对细胞多能性和基因组重编程的认知，并且为解决临床治疗引起的免疫排斥问题和人胚胎干细胞基础研究所面临的伦理学困境带来了曙光，因此该技术自诞生就引发了iPSCs研究的热潮，各实验组迅速围绕iPSCs建系过程中的筛选标记、载体系统、转录因子、源头细胞类型和促进效率提高的化合物筛选等方面展开广泛的研究。

2 猪类胚胎干细胞的研究进展

猪ESCs建系的研究始于1990年，建系过程主要依赖于小鼠等物种ESCs建系的经验，所获得的干细胞系均无法与小鼠ESCs媲美，主要表现是体内形成畸胎瘤的能力、体外自发或诱导向三胚层分化的能力以及生殖系嵌合的能力均较弱。因此，猪ESCs多被命名为“猪类胚胎干细胞”（猪类ESCs）。本文将从猪类ESCs的来源、培养体系和其它影响建系的因素三方面对猪类ESCs研究进展进行阐述（表1）。

图1 多能干细胞的起源（以小鼠为例）

首先，细胞来源方面主要包括以下三部分内容。第一，关于猪类ESCs建系所使用的源头细胞的种类：猪类ESCs主要来源于囊胚内细胞团，虽然Li等［13］和Chen等［14］分别用4-8细胞阶段的胚胎和桑葚胚作为材料进行建系，但由于胚胎贴壁率低、原代克隆无法形成等原因均未获得稳定传代的猪类ESCs。所以，迄今为止的猪类ESCs均来源于囊胚。第二，关于猪类ESCs建系所使用的囊胚的种类：2000年以前的研究主要使用体内囊胚作为实验材料，在这之后开始使用体外受精囊胚、孤雌囊胚和核移植囊胚作为实验材料［15-17］。Miyoshi等［18］用体外受精囊胚分离得到上皮样的猪类ESCs，该细胞系用做核移植供体细胞后，能支持重构胚发育到囊胚阶段。Telugu等［19］和Haraguchi等［20］利用iPSCs技术和小分子体系成功地从体外受精囊胚中分离得到能够稳定传代的内细胞团样的猪类ESCs。Kim等［21］、Park等［22］和Jung等［23］用孤雌囊胚得到了类ESCs。Tan等［24］用不同天数的核移植胚胎获得了类ESCs，但所获得细胞系多能性状态较差。第三，关于猪类ESCs建系所使用的囊胚的时期：从猪囊胚中分离ESCs的最佳时期并不确定，前期研究主要集中在5.5-9 d，各时期的囊胚均能够分离得到类ESCs。Chen等［14］对比了不同发育阶段胚胎的建系效率，结果表明早期孵化囊胚更适合建系，建系效率达21%，这与笔者实验室的研究结果相符（结果暂未发表）。对此，笔者认为将胚胎按照天数划分不能够充分反应胚胎的发育状况，各实验室对胚胎天数的计算也存在差异。这种最佳时间的不确定性是真正制约猪ESCs分离的原因之一，只有对猪胚胎早期发育时程进行系统地研究和划分，找到最适于多能性干细胞分离的时期才有可能分离得到真正的猪ESCs。

其次，培养体系方面。早期研究中使用的培养体系大多源于小鼠ESCs的培养体系，主要成分包括基础培养液DMEM、谷氨酰胺、巯基乙醇、非必需氨基酸、抗生素和胎牛或新生牛血清［25-29］。Moore等［30，31］在培养体系中添加了Lif，但其最终研究结果表明人源Lif无法维持猪类ESCs的多能性状态。近期研究中，各实验组不约而同地将bFGF添加到猪ESCs培养体系中，Hall等［32］的研究也表明bFGF更利于猪类ESCs的分离培养。值得注意的是，Telugu等［19］和Haraguchi等［20］利用iPSCs技术和小分子体系分别建立了猪类ESCs，所获得的细

胞系可以在体外长期培养并有一定的分化能力，两个实验组的培养体系中添加的细胞因子分别是Lif和bFGF，这表明所获得的细胞系完全依赖着两条不同的细胞信号通路，即LIF-STAT3和FGF-MEK。

表1 猪类胚胎干细胞研究进展

最后，影响建系因素方面。影响猪类ESCs建系的主要因素包括饲养层细胞的类型、胚胎接种方式和传代方法。第一，饲养层细胞的选择，目前被广泛使用的是小鼠胎儿成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEF）和STO（永生化的小鼠胚胎成纤维细胞系）细胞系，此外，很多实验室也使用猪胎儿成纤维细胞（Porcine embryonic fibroblasts，PEF）和猪子宫上皮细胞（Porcine uterus epithelial，PUE）作为饲养层细胞。第二，胚胎接种方式，ESCs建系过程中胚胎的接种形式包括内细胞接种和全胚接种［18，21，33］两种方法，内细胞团的分离方法主要有免疫外科手术法［16，34］、三步法［35］和酶消化法［36，37］。第三，传代方法，各实验组主要使用的是胰酶消化或机械切割的方法进行传代，但由于已建成的猪类ESCs在形态上更接近人ESCs，胰酶并不适合此类细胞的消化，因此在人ESCs传代过程中使用的胶原酶和Dispase被逐渐应用在猪ESCs的分离和传代上，同时笔者前期研究结果显示将机械切割法和胶原酶消化法结合起来更适于猪类ESCs的分离和培养（结果暂未发表）。

笔者认为，目前的研究结果显示猪的多能性调控基因和调控网络与小鼠、大鼠以及人可能是不同的，简单地照搬其它物种的ESCs建系经验是不可行的。在诸多影响猪ESCs建系的因素中，能够维持猪ESCs多能性状态的培养液和细胞信号通路是两个主要因素，这就要求我们必需解析猪早期胚胎发育过程中关键基因的表达模式及相关基因的调控网络，以便发现猪多潜能调控与小鼠等物种的区别，从而促进真正的猪多能性干细胞的建立。

3 猪诱导多能干细胞的研究进展

猪胚胎干细胞建系进展缓慢，因此，猪iPSCs的诞生和发展迅速地推动了猪在药物研发、疾病临床研究以及转基因动物生产中的应用，本文对猪iPSCs的起源、转录因子、提高效率的化合物、载体系统和源头细胞的研究进展做详细论述（表2）。

3.1 关于猪iPSCs的起源

猪iPSCs最早建于2009年，Wu等［38］以猪耳缘成纤维细胞和骨髓间充质细胞作为源头细胞，应用可诱导（Tet-on/off系统）慢病毒表达系统向源头细胞内转入人源六因子（Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28）成功地将猪体细胞重编程为iPSCs。同年，Esteban等［39］和Ezashi等［40］分别使用经典四因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc）逆转录病毒诱导体系和慢病毒诱导体系成功地建立猪iPSCs。三个实验组所获得的iPSCs细胞系呈碱性磷酸酶阳性、表达多能性基因、核型正常、能够形成拟胚体和畸胎瘤，但成瘤时间存在较大差异。值得注意的是，所获得的细胞系细胞形态存在较大差异，表达不同的细胞表面标记物，Wu等［38］的iPSCs表达SSEA-3和SSEA-4，Ezashi等［40］的iPSCs表达SSEA-1，这可能是由不同的转录因子和培养体系导致的。

3.2 猪iPSCs转录因子的筛选

2012年，Liu等［41-43］三个实验组分别利用猪源两因子（Oct4和Klf4）和鼠源经典四因子在添加Lif的条件下诱导获得了猪iPSCs，所获得的细胞系形态和多能性都更倾向于小鼠ESCs，能够向三胚层分化，这暗示了Naïve状态的猪iPSCs细胞系依赖的信号通路可能与小鼠胚胎干细胞依赖的信号通路一样，即均依赖LIF-STAT信号通路。同年，Montserrat等［44］报道了在无饲养层的条件下利用三因子（Sox2、Klf4和c-Myc）将猪成纤维细胞重编程为iPSCs。另外，笔者实验室［45］发现，在我们现有的培养体系下［46］，Tbx3和Nr5a2在猪iPSCs诱导的过程中起到了重要作用，这两因子不仅能提高重编程的效率，甚至单独过表达Nr5a2因子就能使猪胎儿成纤维细胞重编成为猪iPSCs，这提示我们必需重新审视各转录因子在猪体细胞重编程及胚胎发育过程中是否起到至关重要的作用。

3.3 在猪iPSCs提高效率的化合物筛选方面

Liu等［41］获得的两因子猪iPSCs需要添加组蛋白去乙酰化抑制剂（Sodium Butyrate）、TGF-β信号通路抑制剂（SB431542）、ERK/MAPK信号通路抑制剂（PD0325901）、GSK3-β抑制剂（CHIR99021）和cAMP信号通路促进剂（Forskolin）这5个小分子化合物才能维持多能性状态，但此时，iPSCs外源基因仍然不沉默，同时我们可以发现当诱导因子减少时则需要更多的外部条件来维持猪iPSCs的多能性。Telugu等［19］和Zhang等［47］分别用内细胞团和脂肪干细胞作为源头细胞，在持续表达外源基因的同时添加小分子（Kenpaullone，KP和CHIR99021）才能维持猪iPSCs的多能性。Gu等［46］通过改善基础培养液的配方，在添加小分子的基础上获得了能够长期传代的形态类似于小鼠ESCs的猪iPSCs，转换后的猪iPSCs两条X染色体处于激活状态，能够获得畸胎瘤。以上团队所得到的实验结果均表明添加小分子化合物可以促进猪iPSCs的获得，但2014年Petkov等［48］发现在猪iPSCs建立过程中添加2i（PD0325901，PD和CHIR99021，CH）会降低猪iPSCs的建系效率和多能性，这与Rodriguez等［49］在猪植入前胚胎的研究结果相近，说明曾在鼠类建系过程中起到重要作用的小分子抑制剂（PD和CH）是否真的适用于猪iPSCs的建立还有待进一步考证。

表2 猪诱导多能性干细胞研究进展

3.4 猪iPSCs载体系统和源头细胞优化

Kues等［50］对猪iPSCs诱导载体进行探索，他们使用Sleeping Beauty转座子质粒共表达鼠源经典四因子，将猪的成纤维细胞诱导为猪iPSCs，该诱导载体进入细胞后，游离在宿主细胞基因组外，这极大地降低了病毒感染过程中病毒重激活的频率，为猪iPSCs后期临床应用和畜牧生产的安全性带来了新的希望。笔者实验室［51］研究结果还发现猪iPSCs诱导效率和其源头细胞的核移植囊胚率呈正相关，不同来源的猪iPSCs细胞系具有相似的、较低的核移植囊胚率，这与之前报道的猪iPSCs核移植效率低并且不能获得核移植后代的结果相符。

现今，小鼠、大鼠、人、猕猴、猪、牛、羊和兔子等物种均成功建立iPSCs。虽然iPSCs已朝着诱导效率高和生物安全性高的方向快速发展，但目前iPSCs产生的具体分子机制仍然未知，其临床应用的安全性也依然有待评估。同样，猪iPSCs面临着外源基因不沉默、内源基因激活不足、自我更新需要外源基因持续表达、无法得到发育到期的核移植胎儿等问题，这都说明我们所获得的猪iPSCs多能性存在缺陷。针对上述问题，猪iPSCs的后续工作应主要集中在非病毒载体和减少因子诱导猪iPSCs、改变猪iPSCs的多能性状态和获得猪iPSCs的嵌合体后代三个方向。

4 猪类胚胎生殖细胞的研究进展

胚胎生殖细胞（EGCs）是胎儿原始生殖细胞（PGCs）在体外建系培养得到的。哺乳动物中，PGCs最早于原条尾部形成，后随原条细胞内卷而到达尿囊附近的卵黄囊背侧内胚层，接着PGCs以阿米巴运动，沿胚胎后肠和肠系膜迁移到中肾腹侧的生殖嵴内，在此PGCs经历表观遗传重编程并最终形成配子。将从胎儿生殖嵴分离的PGCs培养在含有血清和某些特定生长因子的条件下就会阻断其向生殖细胞的特化，最终被重编程为EGCs，由于EGC与小鼠ESCs具有相似的生物学特性，PGCs也就为多能性干细胞的分离提供了一个新的来源。在对猪的研究中，与内细胞团相比，PGCs具有易获得、数量大、发育时辰长和种间差异小等优点，更适于猪多能性干细胞系的建立。

猪的EGC最早建系于1997年，Shim等［56］以24-25日龄猪的生殖嵴为原材料建立了猪EGCs，该细胞系可以产生嵌合体猪；Piedrahita等［57］成功地对EGCs进行转基因操作，获得了转基因嵌合体猪。目前已有包括笔者实验室［58］在内的多个实验组报道了他们对猪EGCs的研究工作，但所获得的猪EGCs只是部分符合ESCs的鉴定标准，真正具有生殖系嵌合能力的猪EGCs还未被建立，这些所获得的猪EGCs也只能被称为“猪类胚胎生殖细胞”（猪类EGCs）。

虽然已有研究者对猪EGCs培养体系进行了探索，例如，基础培养基和血清的选择［59］、饲养层细胞的比较［60］、猪EGCs建系最适胚胎日龄的选择［58］以及细胞因子和小分子的使用等［61］，但是这都无法从根本上解决猪EGCs建系难的问题。笔者认为，只有立足于猪PGCs本身生物学特性、深入了解PGCs多能性维持的机制和积极探索生殖系标志基因表达模式才能够有效地促进猪EGCs的最终建立。

5 猪多能性干细胞的鉴定标准

多能性干细胞的鉴定主要包括以下几个内容：碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）的活性检测，细胞表面标记物及多能性因子的检测，体外定向分化或自发分化潜能的检测，畸胎瘤和嵌合体的检测、生殖系嵌合能力以及四倍体补偿能力的检测。另外，核型检测、启动子甲基化分析、X染色体状态分析、端粒酶活性分析和基因图谱分析等均可作为多能性鉴定的辅助指标。在所有鉴定指标中，最严格的检测标准是生殖系嵌合能力和四倍体补偿能力的检测，这也是多能干细胞鉴定的“黄金标准”。

猪类ESCs和猪类EGCs早期的鉴定指标主要是形态学观察和拟胚体（Embryonic body，EB）分化实验。猪类ESCs根据形态可被分为两类，分别是内细胞团样的克隆和上皮样的克隆，这两类克隆均能在体外长期培养并形成EB，说明细胞形态和分化潜能并无直接关联，这促进了分子检测和细胞水平上筛选纯化的发展。分子检测始于1993年，主要是碱性磷酸酶和阶段特异性胚胎抗原-1（Stage specific embryonic antigen-1，SSEA-1）的表达被作为多能性的标记［35，52］。近年来的研究中已将核型分析、干细胞的定向分化、转录因子启动子甲基化状态分析、X染色体激活状态分析、端粒酶活性分析和畸胎瘤分化分析应用到猪类ESCs的建系过程中［17，22，23，62］，生殖系嵌合能力虽然已被作为检查指标，但一直没有细胞系能够获得具有生殖系嵌合能力的嵌合体动物。所以总的来看，已建成的猪类ESCs都只能在某一方面达到真正ESCs的要求。猪类EGCs的鉴定标准以及发展进程与此相似，此处不做赘述。

猪iPSCs的鉴定指标较为完善，主要是依循小鼠ESCs的鉴定标准，除了小鼠ESCs的“黄金标准”外，其余各鉴定指标猪iPSCs均可满足。值得注意的是，West等［53，54］和Fujishiro等［55］报道他们诱导培养得到了能够生产嵌合体猪的iPSCs细胞系，所获得的胎猪或仔猪中并没有明显肿瘤的形成，在West等的研究结果中，共有4头妊娠个体发育到期，出生仔猪数为36头（34活，2死），成活个体中29头为嵌合体（85.3%），但作为嵌合体的判断依据仅有外源基因的RT-PCR结果，所以此结果的准确性有待商榷。

猪多能性干细胞的研究领域仍然存在许多问题有待解决，例如，如何高效地获得各类猪多能性干细胞，如何维持其自我更新和分化的能力，如何得到发育到期的核移植和嵌合体胎儿，如何提高其在科研应用中的安全性，如何定向诱导猪多能性干细胞向某一特定类型的细胞分化并将其作为医学治疗的临床前研究工具等，这些问题的解决有待于从根本上阐明体细胞重编程、猪多能性干细胞自我更新和定向分化的分子调控机制。猪基因组图谱的公布使得人们更易于找到维持猪多能性干细胞状态的细胞信号通路，通过筛选相应的细胞因子和小分子超激活或抑制该信号通路，剔除可能诱使猪多能性干细胞遗传物质发生改变的因素，使得建立真正的猪多能性干细胞系成为可能。

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Porcine Pluripotent Stem Cells：Facts，Challenges and Hopes

Xue Binghua Liu Zhonghua
（Lab of Embryo Biotechnology，Northeast Agriculture University，Harbin 150030）

Pluripotent stem cells, including embryonic stem cells, embryonic germ cells and induced pluripotent stem cells, have the ability to differentiate into a variety of specific cell lines. Swine is considered as a kind of ideal model for pre-clinical development of human xenotransplantation, therapeutic approaches and regenerative medicine due to its morphological and functional affinity with man. However, a number of open questions need to be addressed since we know little about the sorting, derivation, characterization and mechanisms of porcine pluripotent stem cells. In this review, we elaborated the latest progresses on the derivation of porcine pluripotent stem cells, the evaluation criteria of stemness, scientific and technique questions encountere, and we also provide our perspectives on the future study ofporcine pluripotentstem cells research, in the hope of sharing experimence of exploring this field with other researchers.

swine；pluripotent stem cells；embryonic stem cells；induced pluripotent stem cells；embryonic germ cells

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.009

2015-02-11

“973”重大科学问题导向项目（2011CBA01006），国家自然科学基金项目（31371457）

薛冰华，女，博士研究生，研究方向：多能性干细胞；E-mail：xuebinghua123@126.com

刘忠华，男，博士，教授，研究方向：发育生物学；E-mail：liu86@126.com