富G 寡核苷酸-N-甲基卟啉二丙酸荧光法测定铀

李名慧，王永生

(南华大学 公共卫生学院，湖南 衡阳 421001)

铀是一种无处不在的放射性元素。在工业废弃物中，铀主要呈阳离子复合物如氟化铀酰、碳酸铀酰、磷酸铀酰或硫酸铀酰等形式存在;在水溶液中，六价铀最为稳定［1］。随着经济社会发展，铀在军事和核能方面的应用日益增加，人们有更多的机会暴露于这种有害金属。因此，建立一种经济、快捷测铀的新方法也就势在必行。本文基于富G 寡核苷酸形成的G-四聚体能与NMM 作用导致荧光显著增强［2-4］，而UO2+2与NMM 在酸性环境下作用导致荧光猝灭，并抑制NMM 与G-四聚体的作用，且荧光强度变化值与UO2+2浓度在一定范围内线性相关的原理，建立了富G 寡核苷酸-N-甲基卟啉二丙酸荧光法测定铀的新方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

醋酸双氧铀、NMM、HEPES、MES、Tris-HCl 等均为分析纯;DNA 制品:5’-AGGAAGATGGGAGGGAGGGAGGGTACTAT-3’;实验用水均为灭菌超纯水(电阻为18.26 MΩ);NMM 按照文献［4-5］配制。

UV-2550 紫外-可见分光光度计;F-4500 荧光分光光度计;AB204-S 电子分析天平;PB-21 型精密酸度计。

1.2 实验方法

取35 μL 2.16 ×10－6mol/L NMM 溶液，不同体积1.0 ×10－5mol/L UO2+2 标准溶液，40 μL pH 5.5的HEPES 缓冲溶液，40 μL 1. 0 mol/L KCl 溶液，40 μL 1.0 mol/L NaCl 溶液，依次加入2 mL EP 管中，用蒸馏水定容至450 μL，摇匀，常温下反应20 min，加入50 μL 1.0 ×10－6mol/L DNA，室温反应20 min，在荧光分光光度计进行560 ～700 nm 波长范围内扫描，设置λex= 399 nm，在λmax= 609 nm处记录空白组F0和实验组F，得ΔF=F0－F。

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱特征

荧光光谱分析见图1。

图1 NMM--G-四聚体体系荧光光谱图Fig.1 Fluorescence spectra of the NMM--Gquadruplex system

NMM 本身具有微弱的荧光。NMM 能够特异性地识别G-四聚体［5］，导致体系的荧光强度显著增强(图1，曲线1)。在酸性环境中，可与之发生反应猝灭荧光。应用不同浓度的在酸性环境下与一定量的NMM 作用后，再加入适量的G 四聚体，此时溶液中剩余的NMM 可与G 四聚体结合，使荧光增强。浓度越高，则剩余的NMM 量就越少，体系相应的荧光值也就越低，即浓度与体系的荧光值大小成反比(图1，曲线2 ～10)。由此说明，在实验条件下，NMM 可能与作用形成复合物。与游离的NMM 不同，可能形成的NMM-复合物不能通过π-π 堆积作用而结合到G-四聚体表面，导致体系的荧光猝灭，且与浓度线性相关。

2.2 实验条件的优化

2.2.1 缓冲溶液和pH 的选择 分别在pH 5.5 的MES、HEPES、Tris-HCl 3 种缓冲体系中进行实验，见图2。

图2 pH 值对荧光值的影响Fig.2 Effect of pH value on the fluorescence cDNA =0.1 ×10 －6 mol/L;cNMM =0.15 ×10 －6 mol/L;cUO22+ =0.4 ×10 －6 mol/L

由图2 可知，该反应体系在HEPES 缓冲溶液中变化最明显。在HEPES 缓冲溶液中，在pH 5.5 处ΔF 值最大;当pH 接近中性时，反应趋于终止。故本实验选择pH 5.5 的HEPES 缓冲溶液控制体系的酸度。

2.2.2 KCl 和NaCl 浓度对反应体系的影响 研究了不同浓度KCl 和NaCl 对荧光值的影响，结果表明，当KCl 和NaCl 的浓度均为80 mmol/L 时，体系荧光值变化最明显。所以本实验采用80 mmol/L 作为KCl 和NaCl 的最优浓度。

2.2.3 反应温度对体系的影响 将反应体系分别在10，20，30，40，50，60，70，80，90 ℃的温度下进行反应。结果显示，反应在30 ℃时效果最好。温度过低，分子运动速度慢;温度过高时，形成的G-四聚体不稳定，NMM 无法与G-四聚体结合，从而影响实验结果。

2.3 干扰物质的影响

为了评价本实验对待测物的选择性，根据环境样品中其它金属离子可能共存的情况，进行了干扰实验。在相对标准偏差不超过10%的情况下，5 倍的Cu2+;10 倍的Ca2+;25 倍的Mg2+、Ni2+、Co2+、Pb2+;100 倍的Fe3+、Mn2+、Cr3+;200 倍的Hg2+、Cd2+均不会干扰实验测定。由此可看出，各金属离子对本方法的干扰较小，用本方法测选择性高。

2.4 标准曲线、检出限及精密度

依照实验方法，加入不同浓度的铀标准溶液进行实验，绘制标准曲线见图3。

由图3 可知，在1.29 ×10－7～7.0 ×10－6mol/L范围内，浓度与ΔF 呈线性关系，其回归方程为:ΔF=4.91 +3.91 c(×10－7mol/L)，r=0.999 4。

根据CL= 3sb/k(sb为11 次空白值标准偏差，k为直线回归方程的斜率)公式计算检测限为3.86 ×10－8mol/L。平行配制11 管浓度分别为2. 0 ×10－7mol/L，1.6 ×10－6mol/L，5.0 ×10－6mol/L 的铀标准溶液进行精密度的测定，其相对标准偏差分别为2.7%，3.9%和2.3%。

2.5 样品分析

表1 样品中测定结果(n=6)Table 1 Determination results ofin the samples

表1 样品中测定结果(n=6)Table 1 Determination results ofin the samples

样品 测定方法 测定值/(mol·L －1) RSD/% 加标量/(mol·L －1) 测定总值/(mol·L －1) 回收率/% t 1 a 7.97 ×10 －7 0.70 5.0 ×10 －7 12.96 ×10 －7 99.8 1.06 b 7.93 ×10 －7 0.56 5.0 ×10 －7 12.75 ×10 －7 96.3 2 9.93 ×10 －7 2.15 5.0 ×10 －7 14.86 ×10 －7 98.5 2.07 b 10.16 ×10 －7 2.70 5.0 ×10 －7 15.01 ×10 －7 a 97.1

3 结论

［1］ Solgy M，Taghizadeh M，Ghoddocynejad D. Adsorption of uranium(VI)from sulphate solutions using Amberlite IRA-402 resin:Equilibrium，kinetics and thermodynamics study［J］.Annals of Nuclear Energy，2015，75:132-138.

［2］ Hu D，Pu F，Huang Z，et al. A quadruplex-based，labelfree，and real-time fluorescence assay for RNase H activity and inhibition［J］. Chemistry，2010，16(8):2605-2610.

［3］ Qin H，Ren J，Wang J，et al. G-quadruplex facilitated turn-off fluorescent chemosensor for selective detection of cupric ion［J］. Chem Commun(Camb)，2010，46(39):7385-7387.

［4］ Zhao C，Wu L，Ren J，et al.A label-free fluorescent turnon enzymatic amplification assay for DNA detection using ligand-responsive G-quadruplex formation［J］. Chem Commun (Camb)，2011，47(19):5461-5463.

［5］ Guo L，Nie D，Qiu C，et al. A G-quadruplex based labelfree fluorescent biosensor for lead ion［J］.Biosens Bioelectron，2012，35(1):123-127.