发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族原核表达载体的构建及其表达

周永红，张慧，成熙，柳国艳Δ，张黎明Δ

(1.第二军医大学 海洋生物医药研究中心，上海 200433；2.第二军医大学 海医系海洋生物技术教研室，上海 200433)



发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族原核表达载体的构建及其表达

周永红1,2，张慧1,2，成熙1,2，柳国艳1,2Δ，张黎明1,2Δ

(1.第二军医大学 海洋生物医药研究中心，上海 200433；2.第二军医大学 海医系海洋生物技术教研室，上海 200433)

目的 获得发形霞水母丝氨酸蛋白酶，为深入研究发形霞水母丝氨酸蛋白酶的功能奠定基础。方法 综合运用生物信息学分析发形霞水母丝氨酸蛋白酶分子的序列特征和活性功能。通过设计带有特异性酶切位点的引物，将编码发形霞水母丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列(CcSP1,CcSP2 和 CcSP3)从cDNA文库中扩增出来，利用pET-24a(+)载体构建重组表达质粒(pET24a-CcSP1、pET24a-CcSP2和pET24a-CcSP3)，经过筛选和鉴定正确后转入表达菌Rosetta(DE3).plysS。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下表达，利用SDS-PAGE电泳和Western-blot分析表达的重组蛋白。结果 SDS-PAGE电泳结果可见重组质粒转化的表达菌分别在34、42和30kDa处有蛋白条带，Western-blot检测显示，这些蛋白可特异性与抗His抗体反应，分别与预测重组蛋白分子量一致，鉴定为正确表达的目的重组蛋白。结论 本研究成功构建了发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族原核表达载体，获得了目标蛋白，为进一步研究水母丝氨酸蛋白酶的活性和功能奠定基础。

发形霞水母；丝氨酸蛋白酶；原核表达；重组蛋白

水母属刺胞动物门，是一类分布广泛、生物总量庞大的海洋浮游动物。近年来，全球许多海域多次出现了大规模水母暴发现象。水母的暴发对海洋渔业、海滨旅游、沿岸工业和涉海人员安全等造成很大威胁，是继有害藻华之后最大的海洋生态灾害。事实上，水母也是对人类伤害最大的海洋动物，水母蜇伤是最常见的海洋生物伤[1-3]。水母触手上密布刺丝囊，当触及人体或动物体时，发射刺丝进行袭击，同时释放出毒液，引起局部疼痛、瘙痒、红疹等症状，严重时可以导致呼吸、循环衰竭甚至死亡[4-5]。研究表明[3,6-9]，水母毒素是一类主要存在于触手组织中，包含多种毒性组分的蛋白质与多肽类毒素。水母毒素毒性大、活性强，具有溶血性、心血管毒性、酶活性、神经毒性、肌肉毒性以及肝脏毒性等多种生物活性。

为探究与水母毒素生理活性密切相关的功能基因的表达情况，深入研究水母毒素蛋白的结构、性质及生物学活性，本研究构建了我国东南海域的主要致伤水母发形霞水母(Cyaneacapillata)触手组织cDNA文库，利用大规模测序及生物信息学分析等手段获得了包括金属蛋白酶、离子通道蛋白、凝集素、抗氧化酶类等在内的一系列活性因子的编码序列。本研究发现其中3条序列的开放阅读框所编码的氨基酸序列与丝氨酸蛋白酶家族(serine proteinases，SP)高度同源，均包含一个典型的丝氨酸蛋白酶样结构域，表明这3条序列所编码的蛋白同属丝氨酸蛋白酶家族。丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，通过对蛋白酶原的激活或抑制而发挥调节因子效应，在生物有机体中具有重要而广泛的生理作用[10-11]。本研究将构建发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族的原核重组表达载体，获得重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶，为进一步研究其活性及其在水母蜇伤过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 发形霞水母触手组织cDNA文库(本课题组构建)[12]。pET-24a(+)载体购于美国Novagen公司。菌株E.coliDH5α和Rosetta(DE3).plysS购于北京博迈德生物科技有限公司。限制性内切酶 (EcoR I、Xho I，Nco I和Hind III)、T4DNA连接酶和2×Taq Master Mix购自美国NEB公司。蛋白Marker(170kDa)，DNA分子量Marker(DL 1 000、2 000、15 000)购自日本TaKaRa公司。His标签抗体、HRP-羊抗鼠IgG抗体、PCR产物回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒均购自北京天根生化公司。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)显影液购自美国Thermo公司。

党的十六大以科学发展观为指导，形成了建设生态文明的战略思想。党的十七大把生态文明建设列入全面建设小康社会奋斗目标的新要求并作出战略部署。党的十八大报告更是把生态文明建设放在事关全面建设小康社会非常突出的战略地位，指出只有树立尊重自然、顺应自然、保护自然的生态文明理念，才能实现人与自然和谐相处，实现人的全面发展。这种认识已深入社会主义现代化建设的各项事业，高校也不例外。校园文化建设是高校教育的重要组成部分，对青年大学生的成长成才，特别是实现自我教育与自我塑造，有着至关重要的作用。如何将生态文明建设充分融入高校校园文化建设，用生态理念指导校园文化建设，对高校全面、协调、可持续发展具有重要意义。

主要仪器：梯度PCR仪(EDC-810，北京东胜创新生物科技有限公司)、核酸水平电泳槽(BG-subMIDI，美国Bio-Rad公司)、超声波破碎仪(MISONIX，美国Misonix Sonicators公司)、电泳仪(PowerPacTM，美国Bio-Rad公司)、电泳槽(Mini-PROTEANR®Tetra System，美国Bio-Rad公司)、凝胶成像系统(英国Syngene公司的G：BOX系统)。

2.3 重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶的诱导表达 将鉴定正确的重组表达载体pET24a-CcSP1、pET24a-CcSP2和pET24a-CcSP3分别转化入大肠杆菌Rosetta(DE3).plysS中，IPTG分别诱导表达8、10、12 h。SDS-PAGE表明：在重组质粒转化表达菌的超声裂解液、裂解液上清和沉淀中均有目标蛋白表达，分别在约34、42和30 kDa处，与各融合目标蛋白预测的分子量一致。见图5。

发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族与多个其他物种来源的丝氨酸蛋白酶具有非常高的同源性，与海月水母A.aurita来源的SP1最相似。多重序列比对发现，丝氨酸蛋白酶中特异性的活性中心GDSGGP、三联催化残基His， Asp， Ser(即HDS)和酶原激活位点RIVGG(或RVIGG/RVIAG/RIIAG)、CGG、TAAHC(或TASHC)、LGC(或VGE)、GGR(或GGS/GGE/GRQ)、SFG(或SFV/SWG)、ARV(或TPV/)和SWI(或DWI)等序列均在各物种中高度保守[8-19]。见图2。在系统进化树中，发形霞水母丝氨酸蛋白酶被归入无脊椎动物的分支，并与海月水母Aureliaaurita来源的SP1最为相似，进一步印证了多重序列比对的分析结果。见图3。

2.2 发形霞水母丝氨酸蛋白酶重组表达载体的构建 从发形霞水母触手cDNA文库中分别扩增得到不含信号肽、编码成熟蛋白的CcSP1(867 bp)、CcSP2(1113 bp)和CcSP3(780 bp)序列片段，梯度PCR结果表明3条序列的最佳退火温度分别为55.5 ℃、56 ℃和54 ℃(见图4)。利用pET 24a(+)表达载体分别构建以上3条序列的重组表达载体，经酶切、测序验证，结果显示序列连接正确、无任何位点突变，表明重组表达载体构建成功，将鉴定正确的重组质粒分别命名为pET24a-CcSP1、pET24a-CcSP2和pET24a-CcSP3。

1.4 重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶的诱导表达 将鉴定正确的重组质粒转化入E.coliRosetta(DE3).plysS感受态细胞中，利用含卡那青霉素和氯霉素的LB平板分别挑取阳性重组菌和含有空载体pET24a(+)的表达菌， 37 ℃，250 r/min振荡培养过夜。将菌液按5%转种于同种培养液中，37 ℃振荡培养至A600=0.6～0.8，再加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，16 ℃，150 r/min振荡，分别诱导培养8、10、12 h。将菌液转入50 mL离心管，10000×g离心4 min，收集菌体，每管加入10 mL含1%Triton X-100的PBS，冰浴下超声(100 W，72×5 s，间隔30 s)破碎，裂解菌体，分别留取裂解液50 μL进行后续检测。10000×g离心15 min(4 ℃)分别收集上清和沉淀，沉淀分别依次加入2、4、8 M尿素进行溶解，取50 μL进行SDS-PAGE电泳(80V 30 min，120 V 1 h)。

2.1 发形霞水母丝氨酸蛋白酶序列的生物信息学分析 本研究共发现3条发形霞水母丝氨酸蛋白酶全长cDNA序列，分别命名为CcSP1(GenBank：KU140658)、CcSP2(GenBank：KU140659)和CcSP3(GenBank：KU140657)，3种蛋白均含有信号肽，定位于细胞外。CcSP1序列编码含有309个氨基酸残基的蛋白，含1个ShKT毒素结构域和1个丝氨酸蛋白酶Tryp_SPc结构域，分子量33.95 kDa；CcSP2编码含有394个氨基酸残基的蛋白，含2个ShKT毒素结构域和1个丝氨酸蛋白酶Tryp_SPc结构域，分子量42.3 kDa；CcSP3编码含有278个氨基酸残基的蛋白，含1个丝氨酸蛋白酶Tryp_SPc结构域，分子量30.22 kDa。见图1。3种蛋白的理化性质和二级结构分析结果见表1和表2。

2 结果

1.5 重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶的Western-blot鉴定 将各样品进行SDS-PAGE电泳，然后在300 mA 2 h条件下将目的蛋白转移至硝酸纤维素(NV)膜；于含5%脱脂奶粉的TBST溶液中室温封闭3 h，TBST洗涤3次(10 min/次)；将洗好的NV膜浸入TBST稀释的小鼠抗His抗体(1:2000)中，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤NV膜3次后，使用1:4000辣根过氧化物酶(HRP)羊抗小鼠IgG二抗室温孵育3 h，TBST洗涤3次；使用G：BOX系统(英国Syngene公司)进行显影。

图1 发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族结构域示意图红色：信号肽，蓝色：shkT毒素结构域，绿色：Try_SPc结构域Fig.1 Schematic diagram of functional domains of CcSPs.Red:signal peptides,Blue:shkT toxin domains,Green:Try_SPc domains

序列名称氨基酸残基数Mr(kDa)等电点(PI)二硫键亲水性CcSP130933.959.198-0.312CcSP239442.309.2411-0.256CcSP327830.229.185-0.222

表2 发形霞水母丝氨酸蛋白酶序列的二级结构分析Tab.2 Analysis of the secondary structures of CcSPs

1.3 发形霞水母丝氨酸蛋白酶的原核重组表达载体构建 选择原核表达系统载体pET-24a(+)。根据生物信息学分析结果，设计发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族序列扩增引物。CcSP1基因：1A03-F：5′-CCGGAATTCATGTGCAAAGATG-3′(EcoR I)，1A03-R： 5′-CCGCTCGAGATTGTTGATGTAGC-3′(Xho I)；CcSP2基因：13F05-F：5′-CCCATGGATGTGTAAAGATGTC-3′(Nco I)，13F05-R：5′-CCGGAATTCTCCTCTAGCAA-3′(EcoR I)；CcSP3基因：13H02-F：5′-CCCAAGCTTATGTGTTCAGCT-3′(Hind III)，13H02-R：5′-CCGCTCGAGGTTTCTTTTC-3′(Xho I)。以上引物由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增体系(20 μL)：上下引物各0.4 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、模板DNA 1 μg，加ddH2O至总体积为20 μL。程序设定：利用梯度PCR确定最佳退火温度。PCR反应条件为：①95 ℃ 30 s；②95 ℃ 30 s；③50 ℃～60 ℃ 30 s；④68 ℃ 1 min；⑤68 ℃ 5 min。其中②、③、④ 3个步骤在每次反应中循环30次。以含发形霞水母丝氨酸蛋白酶全长cDNA序列的pUC19克隆质粒为模板，分别扩增得到编码SM001-A03(867bp)、SM013-F05(1113bp)和SM013-H02(780bp)成熟蛋白的核苷酸序列，PCR产物回收试剂盒回收、1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。双酶切扩增产物，回收酶切后的DNA片段，用T4 DNA连接酶连接。将连接产物转入感受态E.coliDH5α中，取菌液均匀涂布于含卡那青霉素的LB平板，PCR和酶切检测重组克隆，将检测合格的菌液送至华大基因公司测序。

图2 发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族的多重序列比对 #：丝氨酸蛋白酶中特异性的活性中心GDSGGP；*：三联催化残基His、Asp、Ser；◆：酶原激活位点RIVGG(或RVIGG/RVIAG/RIIAG)；…：CGG标记；____：TAAHC(或TASHC)；□：LGC(或VGE)；&：GGR(或GGS/GGE/GRQ)；○：SFG(或SFV/SWG)；◇：ARV(或TPV)；●：SWI(或DWI)Fig.2 Multiple alignment analysis of CcSPs#:The active site motifs (GDSGGP);*:Aspartic acid (Asp)-histidine (His)-serine (Ser) catalytic triad;◆:Zymogen activation site RIVGG (or RVIGG/RVIAG/RIIAG);…:CGG;____:TAAHC (or TASHC); □:LGC(or VGE);&:GGR (or GGS/GGE/GRQ);○:SFG(or SFV/SWG);◇:ARV(or TPV); ●:SWI(or DWI)

图3 发形霞水母丝氨酸蛋白酶家族的进化树分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CcSPsA.aurita SP1(Genbank：AAO12213.1)；Papilio xuthus SP7(Genbank：BAM17893.1；Anopheles gambiae SP14(Genbank：ACN38264.1)；Lonomia obliqua SP6 (Genbank：AAV91457.2)；Helicoverpa armigera SP3(Genbank：ABP96916.1)

(5) 由上述结论可知,在地震动的作用下钢管塔下横担以下的部位较安全,下横担以上,尤其是中横担以上的部位变形较明显,在塔头处和上中横担之间的部分构件出现了最大应力,在进行抗震分析时需要注意,在必要时需对薄弱的构件进行加强.

图4 CcSP1、CcSP2和CcSP3的梯度PCR扩增结果1-8泳道的温度分别为：52.0 ℃、52.4 ℃、52.7 ℃、53.3 ℃、54.0 ℃、54.8 ℃、55.5 ℃和56.0 ℃Fig.4 Gradient PCR amplification results of CcSPs, CcSP2, CcSP3Lane 1-8: 52.0 ℃，52.4 ℃，52.7 ℃，53.3 ℃，54.0 ℃，54.8 ℃，55.5 ℃ and 56.0 ℃

1.2 发形霞水母丝氨酸蛋白酶序列的生物信息学分析 利用Blast对发形霞水母触手组织cDNA文库全部序列进行同源检索，获得编码丝氨酸蛋白酶质粒的克隆号(SM001-A03、SM013-F05和SM013-H02)。综合运用多种生物信息学软件及在线分析工具，对筛选出的丝氨酸蛋白酶全长cDNA序列及其编码蛋白序列的理化性质、蛋白的二级结构、信号肽、结构域、二硫键、等电点、亲疏水性、亚细胞定位等特征进行分析。通过与不同生物物种间的同类蛋白序列比对，分析其保守结构域。构建进化树，分析其亲缘性。

2.4 重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶的鉴定 Western-blot结果显示，rCcSP1、rCcSP2和rCcSP3可与抗His抗体特异性反应，分子量分别为34 kDa、42 kDa和30 kDa，与预测重组蛋白分子量一致。表明发形霞水母丝氨酸蛋白酶在大肠杆菌E.coliRosetta(DE3).plysS中成功表达。但3种目的蛋白表达量均较低，且大多以包涵体的形式存在于沉淀中，上清表达量较少。见图6。

图5 SDS-PAGE电泳分析重组表达蛋白A：pET24a-CcSP1转化表达菌(8 h); B： pET24a-CcSP2转化表达菌(10 h); C：pET24a-CcSP3转化表达菌(12 h)M：Marker；1：未诱导菌的超声裂解液；2：IPTG诱导菌的超声裂解液; 3：IPTG诱导菌的超声裂解液上清；4：IPTG诱导菌的超声裂解液沉淀箭头所示位置为融合目标蛋白Fig.5 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant CcSPs proteinsA： pET24a-CcSP1 E. coli Rosetta(DE3).plysS(8 h); B：pET24a-CcSP2 E. coli Rosetta(DE3).plysS(10 h);C：pET24a-CcSP3 E.coli Rosetta(DE3).plysS(12 h)lane M: Protein marker; Lane 1: Whole cell sonicated lysates before the IPTG induction; lane 2: Total protein of IPTG induced E. Coli Rosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragment; lane 3: Supernatant of IPTG induced E. Coli Rosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragment; lane 4: Precipitation of IPTG induced E. ColiRosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragmentArrows indicating the position of fusion target proteins

不错，《罕哈冉惠传》中出现了不少反映佛教思想的内容。如学者们指出的，当哈冉惠和他的两个兄弟遭蟒古斯暗害，误食了蟒古斯投下的毒药后，哈冉惠变成了长有九十五颗头的大黑蟒古斯，他的胞弟乌兰岱·莫日根变成了一尊石人，乌兰岱的坐骑变成了一尊石马，他的义兄弟吉尔吉斯·赛因·贝托尔则变成了一头黄色的野猪。是两位公主派出了维兰·索龙嘎的儿子去向菩萨求救，菩萨将三件宝物——万能的金套绳、能起死回生的仙丹、智慧的金盘赐给了小童，小童用此三宝使三位英雄得救，恢复了原貌。菩萨，为众人所知，当然属于重要的佛的形象，然而当菩萨向小童授予三件宝物之前，却说出下面一段颇令人费解的话：

和他玩一些在黑暗中才能玩的游戏，例如做手影，或拿一把小手电，关上灯，引诱他去拍打一开一关的手电筒的光。宝宝玩得兴奋，就忘了黑夜，待到发现黑夜并不可怕，以后就不再不让关灯了。

图6 Western-blot分析重组表达蛋白1：未诱导菌超声裂解液；2：IPTG诱导菌超声裂解液；3：IPTG诱导菌超声裂解液上清；4：IPTG诱导菌超生裂解液沉淀Fig.6 Western-blot analysis with an anti-His antibodyLane 1: Whole cell sonicated lysates before the IPTG induction; lane 2: Total protein of IPTG induced E.coli Rosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragment; lane 3: Supernatant of IPTG induced E.coli Rosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragment; lane 4: Precipitation of IPTG induced E.coli Rosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragment

3 讨论

2008年美国国家科学基金会报道，全球每年被水母蜇伤的总人数达1.5亿[13]。在我国沿海地区，水母蜇伤造成的危害也比较严重。据报道，2013年暑期仅北戴河人民医院就收治水母蜇伤者1053人(截至当年8月7日)[14]。水母蜇伤已成为一个重要的公共卫生问题。研究水母毒素发挥多种强效作用的物质基础，可为阐明水母毒素的组成、毒性作用方式及研发水母蜇伤的防治药物提供科学依据，同时也为充分利用水母毒素，开发新型的海洋生物药物提供先导分子。

2.3.2 专属性 取空白孵育样品（即“2.2.3”项下不含ZG02的两相孵育体系）、ZG02对照样品（即“2.2.3”项下含ZG02的两相孵育体系）、肝微粒体孵育样品[即“2.2.3”项下含ZG02两相孵育体系按“2.2.4”项下方法处理后（孵育30 min时）所得样品]各适量，按“2.3.1”项下色谱与质谱条件进样分析，色谱图见图3。结果，内标和ZG02的峰形均良好，保留时间分别为0.70、1.57 min，孵育体系中的内源性物质并未干扰待测物的测定，提示本方法的专属性良好。

本研究从发形霞水母触手cDNA文库中筛选获得了三条编码丝氨酸蛋白酶的序列，对其结构、序列相似性等进行了分析，CcSP1、CcSP2和CcSP3分别编码33.95、42.3和30.22 kDa的蛋白，均含有信号肽，为分泌蛋白。预测CcSP1、CcSP2和CcSP3的均含有丝氨酸蛋白酶Tryp_SPc结构域，其中CcSP1和CcSP2还具有ShKT毒素结构域，提示CcSPs很可能是作为毒素组分参与发形霞水母的生命活动。此外多重序列比对分析和进化树分析均显示CcSPs与海月水母A.aurita来源的SP1最为相似，根据数据提供者Rojas,A等描述SP1属于胰蛋白酶，提示CcSPs可能作为消化酶而起作用。

已知丝氨酸蛋白酶类广泛存在于蛇、蜘蛛等有毒动物的毒液中，作为毒素因子发挥重要作用，可能参与其他毒素组分的翻译后修饰和扩散。如蛇的毒液中含量最丰富的酶之一——蛇毒丝氨酸蛋白酶(snake venome serine proteinases , SVSPs)，它在凝血或纤溶系统等多个环节中发挥作用，可以干扰凝血自稳机制，并引起组织坏死[15]。本研究通过构建原核重组表达系统获得了表达发形霞水母丝氨酸蛋白酶的大肠杆菌菌株和重组发形霞水母丝氨酸蛋白酶融合蛋白(rCcSP1,rCcSP2和rCcSP3)，分子量分别为34、42和30 kDa，与预测重组蛋白分子量一致，表明得到了正确表达的目的重组蛋白，这为进一步明确发形霞水母丝氨酸蛋白酶的活性、功能及其在水母蜇伤中的毒性作用奠定了基础。

[1] Dong Z,Liu D, Keesing JK. Jellyfish blooms in China: Dominant species, causes and consequences[J].Mar Pollut Bull, 2010, 60(7):954-963.

[2] Fenner PJ, Williamson JA. Fast liquid chromatographic-mass spectrometric determination of pharmaceutical compounds[J].Med J Aust, 1996, 165(11-12):658-661.

[3] Tibballs J. Australian venomous jellyfish, envenomation syndromes, toxins and therapy [J].Toxicon, 2006, 48(7):830-859.

[4] Burnett JW. Medical aspects of jellyfish envenomation: pathogenesis, case reporting and therapy[J].Hydrobiologia, 2001, 155(1-3): 1-9.

[5] Tibballs J. Australian venomous jellyfish, envenomation syndromes, toxins and therapy[J].Toxicon, 2006, 48(7): 830-859.

[6] David AB, Joseph WB，Philip A, et al. Partial purification of box jellyfish (Chiroex fleckeri) nematocyst venom isolated at the beachside[J].Toxicon, 1998, 36(8): 1075-1085.

[7] John JC, Lal AR, Ian MC, et al. Partial purification and characterization of a hemolysin (CAHI) from Hawaiian box jellyfish (Carybdea alata) venom[J].Toxicon, 2001, 39(7): 981-990.

[8] Hiroshi N, Kyoko T, Masahiro N, et al. Isolation and characterization of a novel protein toxin from the Hawaiian box jellyfish (sea wasp) Carybdea alata[J].Biochem Biophys Res Co, 2000, 275(2): 589-594.

[9] Laura G, Massimo A, Bella G, et al. Biologically active polypeptides in the venom of the jellyfish Rhopilema nomadica[J].Toxicon, 1997, 35(5): 637-648.

[10] 张智明.凝血酶的研究进展[J].海峡药学, 2006, 6(6):1-3.

[11] 陈晓翔, 杨程德, 顾越英. 纤溶酶功能研究进展[J].诊断学理论与实践, 2005, 5(5):430-432.

[12] Ruan Z, Liu G, Wang B, et al. First Report of a Peroxiredoxin Homologue in Jellyfish: Molecular Cloning, Expression and Functional Characterization of CcPrx4 from Cyanea capillata[J].Mar Drugs, 2014, 12(1):214-231.

[13] The National Science Foundation, 4201 Wilson Boulevard, Arlington, Virginia 22230[EB].USA. Jellyfish Gone Wild. http://www.nsf.gov/news/special_reports/jellyfish/textonly/biology.jsp.

[14] 王敏. 北戴河今夏海蜇数量激增 超千人被蜇伤[EB].新华网. http://www.hbnews.net/xwsq/gn/szyw/2013/08/703916.shtml.

[15] Serrano SM, Maroun RC. Snake venom serine proteinases: sequence homology vs. substrate specificity, a paradox to be solved[J].Toxicon,2005,45(8):1115-1132.

(编校：谭玲)

Molecular cloning and expression of a serine protease family from JellyfishCyaneacapillata

ZHOU Yong-hong1,2, ZHANG Hui1,2, CHENG Xi1，2, LIU Guo-yan1,2Δ, ZHANG Li-ming1,2Δ

(1.Marine Bio-pharmaceutical Institute, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China; 2 Department of Marine Biotechnology, Faculty of Naval Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

ObjectiveTo obtain a single toxin component from the jellyfishCyaneacapillataand provide a foundation for the further study on bioactivity and function of the serine proteases fromC.capillata.MethodsPrimers designed with restriction enzyme were used to amplify the coding region of cDNAs (CcSP1, CcSP2 and CcSP3). PCR fragments were ligated with the pET-24a(+) vector to construct the recombinant plasmids (pET24a-CcSP1, pET24a-CcSP2 and pET24a-CcSP3). After screening and identification，the recombinant plasmids were transformed into the Rosetta(DE3).plysS for protein expression. After induction with IPTG, SDS-PAGE and Western-blot were used to detect the expression of the recombinant proteins.ResultsSDS-PAGE showed that the proteins of rCcSP1, rCcSP2 and rCcSP3 were expressed in a single band at about 34 kDa, 42 kDa and 42kDa, respectively. Western-blot detection with anti-His antibody further confirmed that these recombinant proteins were His-tagged CcSP1, CcSP2 and CcSP3 fusion protein were obtained.ConclusionProkaryotic recombinant plasmids ofC.capillataserine proteases are contructed and recombinant proteins are obtained, which establishes the foundation for future study on the function of serine proteases from jellyfish.

Cyaneacapillata; serine protease; prokaryotic expression; recombinant protein

国家自然科学基金(41306136; 81370833; 81401578)

周永红，女，硕士，研究方向：海洋生物活性物质研究，E-mail: 171006165@qq.com；张黎明，通信作者，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：海洋生物活性物质以及海洋生物伤防治研究，E-mail:lmzhang@smmu.edu.cn；柳国艳，共同通信作者，女，博士，副教授，研究方向：海洋生物活性物质以及海洋生物伤防治研究，E-mail: lgy_laurie@aliyun.com。

R82

A

1005-1678(2015)12-0001-05