磷脂酰丝氨酸制备关键技术研究

磷脂酰丝氨酸(PS)是一种新资源食品，在制药和功能食品领域具有广泛的应用，能够改善老年人的阿尔茨海默病，具有保护神经和抗氧化作用，还具有提高记忆力、缓解紧张、减轻抑郁等功效，为“脑专一性营养物质”。

PS 的制备方法主要有溶剂提取法、化学合成法和酶转化法。酶转化法具有反应条件温和、反应易控、高效简单等优势，逐渐得到广泛的研究及应用。 如，江南大学江波教授团队（2020）采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶层析对广岛链霉菌SK43.001-11 发酵液中的磷脂酶D 进行纯化， 并对双液相体系中酶法制备磷脂酰丝氨酸的工艺进行研究。 结果表明：纯化后，磷脂酶D 比酶活提高到49.48 U/mg，是粗酶液的54.37 倍，回收率为32.31%。磷脂酶D 双液相催化制备磷脂酰丝氨酸的最佳条件为：有机相为乙醚，pH 6.5，反应温度30 ℃，L-丝氨酸与磷脂酰胆碱质量比15∶1，有机相与水相体积比1∶1，反应时间2.5 h。 在最佳条件下，磷脂酰丝氨酸生成率达到74.8%。Liu 等(2014)利用基因工程和分子技术手段将PLD 成功展示在酵母表面，在进行酶转化实验中，可以将67.5%的磷脂酰胆碱转化为PS。中国专利CN201710554483.3 提供了一种催化合成磷脂酰丝氨酸的生物酶及其制备方法和应用，首先构建生物酶的基因工程菌株，将全基因合成的生物酶基因片段，利用限制性内切酶SalⅠ线性化重组质粒，用于表达生物酶，经过进一步发酵获得催化合成磷脂酰丝氨酸的生物酶，利用磷脂酰丝氨酸合成酶高度专一性，催化卵磷脂和丝氨酸制备磷脂酰丝氨酸，转化率达到80%。CN201610054776.0 涉及一株谷氨酸棒杆菌及其过量合成磷脂酰丝氨酸的方法。其提供了一株谷氨酸棒杆菌基因工程菌，该菌株是将谷氨酸棒杆菌宿主细胞中表达L-丝氨酸脱氨酶的sdaA 基因进行敲除， 并串联表达磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因pssA 基因、3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变基因serAΔ197 基因和CDP-甘油二酯合成酶的表达基因cdsA 基因而获得， 该菌株经发酵法制备磷脂酰丝氨酸产量较出发菌株提高17%～39%。CN201110382207.6 提供一种酶法制备磷脂酰丝氨酸的方法。 大豆磷脂酰胆碱溶于有机溶剂中，加入一定量溶有2%～8%的丝氨酸水溶液，调节pH 5.6，在磷脂酶D 催化下进行碱基交换，经过4 h 反应，大豆磷脂酰胆碱转化为磷脂酰丝氨酸，反应物通过水洗有机相，经脱水脱溶后，用丙酮充分洗涤， 分离出丙酮不溶物， 干燥得产品。 经过HPLC 测定， 产品磷脂酰丝氨酸的含量大于40%。CN201310508296.3 提供一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，包括以下步骤：将磷脂酰胆碱或含有磷脂酰胆碱的天然磷脂与吐温-80、L-丝氨酸、氯化钙、缓冲溶液、磷脂酶D 混合，在35～45 ℃搅拌反应8～10 h；反应结束后反应粗品析出并上浮，离心分离水相和反应粗品，将分离得到的反应粗品用水洗涤，并离心过滤；离心过滤后的反应粗品加入无水乙醇浸泡，搅拌，再离心过滤；对离心过滤后产物真空干燥，即得磷脂酰丝氨酸产品。 CN201710498577.3 公开了一种利用固定化磷脂酶D 生产磷脂酰丝氨酸的方法，配制表面活性剂水溶液，室温下边搅拌边滴加游离酶水溶液至澄清，得混合液；将混合液滴加至金属离子盐溶液中，室温下搅拌反应0.5～2 h 后得固定化的酶溶液；离心，干燥得到固定化的磷脂酶催化剂；将溶于有机相中的卵磷脂、丝氨酸溶液与固定化酶进行转化反应，温度0～40 ℃，时间1～24 h。 CN201910996555.9 提供了一种重组磷脂酶D， 是通过大肠杆菌表面展示技术高通量筛选技术和DNA 基因重组技术筛选获得新型的PLD。CN201710462045.4 涉及一种连续高效酶转化合成食品用磷脂酰丝氨酸的方法。 通过将磷脂酶D 负载于高吸附气凝胶多孔材料，从而提高磷脂酶D 的反应活性和转化催化效能，使得在短时间内完成磷脂酰丝氨酸的催化合成反应；进一步通过高压下在窄流道中进行有机相、水相的反应，不但反应效率高，而且窄流到流体均化反应，反应均匀，易于稳定控制。 CN201410279967.8 涉及一种利用高活力磷脂酶A2 和高活力磷脂酶D 催化制备sn-2 位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸(2-DHA-PS)的方法。 通过重叠PCR 技术实现定向进化，获得高活力磷脂酶A2 和高活力磷脂酶D；利用高活力磷脂酶A2 和高活力磷脂酶D 催化制备2-DHA-PS，首先磷脂酰胆碱和丝氨酸在高活力磷脂酶D 的催化下生成磷脂酰丝氨酸，然后磷脂酰丝氨酸再与二十二碳六烯酸在高活力磷脂酶A2 的催化下生成2-DHA-PS。

目前国内外研究者主要集中在PS 的提取、生物合成及应用等方面开展研究，而PS 的产品开发应用还处于发展初期。 未来随着绿色生物酶法技术的发展、PS 多种生理保健功能的进一步开发，PS 将在食品、药品领域拥有更广阔的前景。