HPLC法同时测定脉络宁注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

周长凯，高静，史士强，郝丽萍，荆凡波Δ

(1.青岛大学附属医院 药剂科，山东 青岛 266100；2.青岛市第三人民医院 药剂科，山东 青岛 266041)



HPLC法同时测定脉络宁注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

周长凯1，高静2，史士强1，郝丽萍1，荆凡波1Δ

(1.青岛大学附属医院 药剂科，山东 青岛 266100；2.青岛市第三人民医院 药剂科，山东 青岛 266041)

目的 建立脉络宁注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量检测方法。方法 采用高效液相色谱法对脉络宁注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量进行检测，色谱条件为：色谱柱为SunfireTMC18柱(4.6 mm×15 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.03%磷酸水溶液梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm。结果 哈巴苷在0.1424～0.8544 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.9998)，平均回收率98.22%，RSD=1.46%(n=6)，哈巴俄苷在0.0732～0.4392 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.9997)，平均回收率99.27%，RSD=1.42%(n=6)。结论 该法操作简便，准确可靠，可作为脉络宁注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量测定方法。

脉络宁注射液；哈巴苷；哈巴俄苷；含量测定；高效液相色谱法

脉络宁注射液由金银花、玄参、牛膝、石斛组成，具有清热养阴、活血化瘀的功效，用于治疗血栓闭塞性脉管炎、静脉血栓形成、动脉硬化性闭寒症、脑血栓形成及其后遗症等[1]。其作用机制与抗凝、溶栓、解痉、止痛、扩张血管、改善微循环以及抗自由基等有关。脉络宁注射液已有20余年的生产经验，有较高的市场占有率，在防治各种急、慢性心脑血管等疾病中具有起效快、疗效好、不良反应少等优点[2]。

组方药材玄参系玄参科植物玄参(ScrophularianingpoensisHemsl.)的干燥根，具有清热凉血、滋阴降火、解毒散结的功效。主治身热烦渴、咽喉肿痛、瘰疬痰核、痈疽疮毒等症。玄参中含有多种环烯醚萜苷类成分，其中哈巴苷和哈巴俄苷含量最高。药理研究发现哈巴苷和哈巴俄苷具有较强的抗炎、神经保护、增强免疫等作用，为玄参的特征性有效成分[3]。2010年版《中国药典》以哈巴苷和哈巴俄苷的含量作为玄参药材的质量控制标准[4]。目前未见脉络宁注射液中哈巴苷和哈巴俄苷含量测定的报道，本文旨在采用高效液相色谱同时测定脉络宁注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量，以期为该制剂的质量控制提供快速、准确的测定方法。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 3批脉络宁注射液(金陵药业股份有限公司，批号分别为20150109、20150110、20150111)；哈巴苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111729-200907)；哈巴俄苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111730-200903)；乙腈(美国Fisher公司，色谱纯)；娃哈哈纯净水；其他为分析纯(北京高华伟业化学品有限责任公司)。

1.2 仪器 Waters 2690高效液相色谱系统，包括四元高压梯度泵系统，2998型PDA检测器，柱温控制系统，自动进样系统(美国Waters公司)；Sartorius BP211D电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件：色谱柱：SunfireTMC18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.03%磷酸水溶液溶梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：35 ℃。梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Tab.1 Conditions of gradient elution

1.3.2 对照品溶液制备：分别精密称取哈巴苷对照品7.12 mg、哈巴俄苷对照品3.66 mg于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成每1 mL含哈巴苷0.712 mg、哈巴俄苷0.366 mg的溶液，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，制成每1 mL分别含哈巴苷0.0712 mg、哈巴俄苷0.0366 mg的混合溶液，精密吸取上述混合对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL，按上述色谱条件，分别进样，测定。

1.3.3 供试品溶液制备：精密量取脉络宁注射液2 mL至10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.4 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.3.4 系统适应性：依上述色谱条件，精密吸取混合对照品溶液10 μL、供试品溶液20 μL，分别进样。

1.3.5 线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液(每1 mL分别含哈巴苷0.071 μg、哈巴俄苷0.0366 μg)各2、4、6、8、10、12 μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。

1.3.6 精密度考察 取脉络宁注射液供试品溶液，重复进样6次，每次20 μL，注入液相色谱仪，测定色谱峰峰面积。

1.3.7 重复性考察：取同一批样品6份，按“1.3.3 供试品溶液制备”项下方法制备供试品溶液，测定哈巴苷、哈巴俄苷色谱峰峰面积，计算含量。

1.3.8 稳定性考察：取脉络宁注射液供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h进样每次20 μL，测定哈巴苷、哈巴俄苷色谱峰峰面积。

1.3.9 回收率试验：精密量取已知含量的脉络宁注射液1 mL(含哈巴苷3.175 g/L，哈巴俄苷0.4182 g/L)6份，置100 mL容量瓶中，分别精密添加一定量的对照品溶液，按“1.3.3供试品溶液制备”项下方法制得供试品溶液，分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算哈巴苷和哈巴俄苷的加样回收率。

1.4 样品含量测定：分别取3批脉络宁注射液，按“1.3.3 供试品溶液制备”项下方法制备供试品，按“1.3.1 色谱条件”项下色谱条件测定，采用外标一点法计算哈巴苷、哈巴俄苷的含量。

2 结果

2.1 系统适应性 在对照品溶液和供试品溶液色谱图相应位置上，有相同保留时间的色谱峰，见图1。图1表明建立的色谱条件能将哈巴苷、哈巴俄苷很好地分离。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.脉络宁注射液；1.哈巴俄苷；2.哈巴苷Fig.1 HPLC chromatogramsA.Reference substance;B.Mailuoning injection; 1.Harpagoside;2.Harpagide

2.2 线性关系考察 以对照品进样量(X)为横坐标，色谱峰峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，哈巴苷回归方程分别为：Y=2854.7X-12.133，r=0.9998。哈巴俄苷回归方程为Y=1815.4X+324.73，r=0.9997。结果表明哈巴苷进样量0.1424～0.8544 μg范围内线性关系良好，哈巴俄苷进样量在0.0732～0.4392 μg范围内线性关系良好。

2.3 精密度考察 哈巴苷、哈巴俄苷色谱峰峰面积RSD分别为0.72%，1.29%(n=6)。结果表明仪器精密度良好。

2.4 重复性考察 哈巴苷的平均含量为3.175 g/L(RSD=2.31%)；哈巴俄苷的平均含量为0.4182 g/L(RSD=1.97%)。结果表明建立的方法重复性良好。

2.5 稳定性考察 计算RSD分别为2.01%，1.82%。结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.6 回收率试验 哈巴苷和哈巴俄苷的加样。平均回收率分别为98.22%，99.27%。见表2、表3。

表2 脉络宁注射液中哈巴苷回收率实验结果(n=6)Tab.2 The recovery experiment results of harpagide in Mailuoning injection(n=6)

表3 脉络宁注射液中哈巴俄苷回收率实验结果(n=6)Tab.3 The recovery experiment results of harpagoside in Mailuoning injection(n=6)

2.7 样品含量测定 样品含量测定结果见表4。

表4 3批脉络宁注射液中哈巴苷、哈巴俄苷含量测定结果(n=3)Fig.4 Determination results of harpagide and harpagoside in 3 batches of Mailuoning injection(n=3)

3 讨论

本实验曾采用乙腈-0.03%磷酸水溶液等度洗脱，但注射液中成分复杂，所得色谱峰峰形差，特征峰难以区分，经不断摸索最终选定文中梯度洗脱条件，并进行了相应方法学考察。脉络宁注射液是由金银花、玄参、牛膝等中药精制提取而成的一种复方制剂[6]。金银花性寒、味甘、气芳香，具有清热解毒，凉散风热之功效。玄参味甘、苦、咸；性微寒；归肺，胃，肾经；玄参，禀至阴之性，专主热病，味苦则泄降下行，故能治脏腑热结等证。牛膝性味苦甘酸平，具有活血通经，补肝肾，强筋骨，利尿通淋，引血(火)下行之功效。石斛，性味甘；微寒。归胃、肺、肾经。治疗热病伤津；口干烦渴；胃阴不足；胃痛干呕；肺燥干咳；虚热不退；阴伤目暗；腰膝软弱。整个方剂合用具有养阴清热、补益肝肾、活血化瘀的功效，临床应用广泛[7]。目前其质量控制方法的研究多集中在酚酸类成分含量测定[8-10]，其他功效成分的测定却鲜见报道。环烯醚萜苷类是玄参中的主要药效成分，其含量对脉络宁注射液的质量具有重要影响。本文建立了HPLC法同时测定脉络宁注射液中哈巴苷和哈巴俄苷含量测定方法，所建立的方法操作简便、准确可靠，为脉络宁注射液的多指标质量控制提供了依据。

[1] 于锋，金亦涛，綦春玉，等.脉络宁注射液药理学研究进展[J].中国新药杂志，2002，11(12)：920-924.

[2] 庞晓斌，谢欣梅，王海燕，等.脉络宁对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[J].中国中药杂志，2014，39(4)：721-725.

[3] 孙国祥，史香芬.玄参的毛细管电泳指纹图谱研究[J].中南药学，2009，7(7)：540-544.

[4] 谢小艳，夏春森.中药玄参的化学成分及药理研究进展[J].亚太传统医药，2010，6(5)：121-125.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：26.

[6] 黄薇，黄蕊茵.葛根素和脉络宁注射液治疗冠心病合并高血压患者的效果观察[J].当代医学，2011，21(1)：155-156..

[7] 完颜长旭，张黎明.脉络宁注射液治疗窦性心动过速160例[J].内蒙古中医药，2013，6(16)：6-7.

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[9] 朱粉霞，丁淑敏，陈斌，等.UPLC法同时测定脉络宁注射液中8种有机酸[J].中成药，2013，35(7)：1449-1452.

[10] 张军，居文政，谈恒山.高效液相色谱法同时测定脉络宁注射液中3种有机酸的含量[J].中国医院药学杂志，2007，27(6)：833-834.

(编校：王冬梅)

Simultaneous determination of harpagide and harpagoside in Mailuoning injection by HPLC

ZHOU Chang-kai1, GAO Jing2, SHI Shi-qiang1, HAO Li-ping1, JING Fan-bo1Δ

(1.Department of Pharmacy, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266100, China; 2.Department of Pharmacy, The Third People’s Hospital of Qingdao, Qingdao 266041, China)

ObjectiveTo establish a method for content determination of harpagide and harpagoside in Mailuoning injection by HPLC.MethodsThe experimental condition of HPLC method was as follows: SunfireTMC18column (4.6 mm×150 mm, 5 μm), with gradient elution using acetonitrile and 0.03% phosphoric acid; the detected wavelength was 210 nm, and the flow rate was 1.0mL/min.ResultsHarpagide and harpagoside demonstrated good linear relationship in the range 0.1424～0.8544 μg/mL(r=0.9998) and 0.0732～0.4392 μg/mL (r=0.9997) respectively.The average recovery rate were 98.22% and 99.27% with RSD of 1.46% and 1.42%(n=6)respectively.ConclusionThe method is simple, reliable, accurate, reproducible and stable, and it could be used in the determination of harpagide and harpagoside in Mailuoning injection.

Mailuoning injection; harpagide; harpagoside; content determination; HPLC

周长凯，男，硕士，药师，研究方向：药物新剂型与新技术、临床药学，E-mail：165643396@qq.com；荆凡波，通讯作者，男，硕士，副主任药师，研究方向：临床药学、药代动力学，E-mail：jingbf178@sina.com。

R286.0

A

1005-1678(2015)08-0173-03