瘤内siRNA干扰血管内皮生长因子对恶性黑色素瘤的放射增敏作用

庞得全，王英曼，戴云飞，白静，郑维国，宫凤玲，赵志宇

(1.华北理工大学附属医院 放疗科，河北 唐山 063000；2.华北理工大学附属医院 血液科，河北 唐山 063000；3.华北理工大学 药理系，河北 唐山 063000；4.华北理工大学附属医院 急诊科，河北 唐山 063000；5.华北理工大学附属医院影像科，河北 唐山 063000；6.华北理工大学附属医院 口腔科，河北 唐山 063000)



瘤内siRNA干扰血管内皮生长因子对恶性黑色素瘤的放射增敏作用

庞得全1，王英曼2，戴云飞1，白静3，郑维国4，宫凤玲5，赵志宇6

(1.华北理工大学附属医院 放疗科，河北 唐山 063000；2.华北理工大学附属医院 血液科，河北 唐山 063000；3.华北理工大学 药理系，河北 唐山 063000；4.华北理工大学附属医院 急诊科，河北 唐山 063000；5.华北理工大学附属医院影像科，河北 唐山 063000；6.华北理工大学附属医院 口腔科，河北 唐山 063000)

目的 研究瘤内siRNA干扰VEGF的表达对恶性黑色素瘤放射敏感性的影响。方法 首先建立恶性黑色素瘤A375细胞的裸鼠移植瘤模型，采用脂质体包裹的小RNA干扰技术，将恶性黑色素瘤移植瘤裸鼠随机分为空白对照组、VEGF阴性质粒组、VEGF阳性质粒组，每周2次测肿瘤体积，计算肿瘤体积抑瘤率；HE染色进行组织形态学观察，计算肿瘤横断面坏死面积率；免疫组化法测定瘤体血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。结果 VEGF阳性质粒组VEGF的表达减弱(P<0.05)，VEGF阳性质粒组有较多的组织坏死，肿瘤生长明显抑制(P<0.05)。结论 瘤内注射脂质体包裹的siRNA-VEGF对恶性黑色素瘤有放射增敏作用，为临床开展针对VEGF基因的靶向治疗和放射治疗的联合治疗恶性黑色素瘤提供了实验依据。

血管内皮生长因子；siRNA；放疗敏感性；恶性黑色素瘤；凋亡

恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是目前发生率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一，恶性度高，预后较差[1]。我国MM较少见，但发病率逐年升高，手术治疗是其主要治疗手段，但我国MM患者因就诊时病期较晚而失去手术机会。放射治疗是治疗恶性肿瘤的重要辅助手段之一，然而恶性黑色素瘤对放射治疗不敏感[2]，限制了放射治疗的应用。如何增加恶性黑色素瘤的放射敏感性一直是放疗研究的热点和重点[3]。通过基因治疗方式改变肿瘤细胞的内在放射敏感性是一种新的增敏方式，它除具有增敏效果外，还具有直接或间接诱导细胞凋亡和刺激免疫反应的作用。

恶性黑色素瘤是一种高血管侵袭性的肿瘤，抑制其血管生成是重要的治疗手段[4]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知活性最强的促血管生成因子，与肿瘤的生长、转移和预后密切相关[5-6]。VEGF是辐射后血管增殖重要的调节因子，它和抗凋亡蛋白Bcl-2具有协同作用，增加机体和肿瘤组织对辐射的抗性。研究表明，恶性黑色素瘤中VEGF表达较色素痣明显增高[7]，缺氧是VEGF最重要的诱导因素，放疗在杀伤肿瘤细胞的同时可加重肿瘤微环境的乏氧状态，诱导VEGF 表达上调，促进乏氧细胞对射线抗拒。因此，VEGF是重要的放疗敏感性的靶点。本实验以VEGF为靶点，应用siRNA干扰技术，在体内观察其对A375细胞放射敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 恶性黑色素瘤细胞A375购自ATCC，用添加了10%胎牛血清(购自Gibco)和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基，置于37 ℃，5%CO2培养箱中常规培养。待细胞融合到80%时传代。

1.1.2 实验动物 SPF级BALB/c雌性裸鼠25只，其中一只用来培养移植瘤，4周龄，体质量14～16 g，由华北理工大学实验动物中心提供[实验动物许可证号：SYXK(冀)2010-0038]，动物实验在华北理工大学SPF级实验动物中心饲养1周后用于试验。

1.1.3 实验材料 细胞培养所用培养基(RPMI 1640)、L-谷氨酰胺以及胎牛血清均购自Gibco公司；VEGF siRNA由上海吉玛生物公司合成；VEGF一抗，二抗购于美国Abcam公司；ECL发光试剂盒购自碧云天公司；其他常规试剂均购自上海国药集团。

1.1.4 仪器：DHP-9272细胞培养箱(上海呈天实验仪器公司)；DYY-11型凝胶电泳仪(北京六一实验仪器公司)；Mias系列图像处理系统购；Eclipse Ci-E正置显微镜(尼康)。

1.2 方法

1.2.1 VEGF-siRNA重组质粒的构建和鉴定：VEGF-siRNA质粒购自上海吉玛生物公司：根据GenBank(access number U75285)人VEGF基因mRNA的已知序列，寻找符合特征的靶序列，使用Genscript公司在线设计软件(http：//www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai)，合成针对编码区(399-417)碱基序列的1条DNA寡核苷酸链，同时设计1条negative序列用于对照组实验，该序列与siRNA序列有相同的组成，但是和VEGF mRNA没有明显的同源性。通过BLAST软件进行序列同源性分析，与人类其他基因无同源性，设计序列如下：

VEGF-siRNA：5’-GAAAGATAGAGCAAGACAAttcaagaga TTG-TCTTGCTCTATCTTTC-3’；对照-siRNA：5’-GTATAAG-TCAACTG-TTGACttcaagagaGTCAACAGTTGACTTATAC-3’。

化学合成各单链DNA片段退火形成双链DNA，定向克隆至BamHⅠ和HindⅢ双切空质粒pRNAT-U6.1中，获得siRNA的表达载体。

1.2.2 恶性黑色素瘤裸鼠皮下种植瘤模型的建立和干预：取对数生长期贴壁生长的A375细胞，胰酶消化，PBS液吹打悬浮细胞，离心5 min，弃上清，PBS液重悬细胞，调整细胞数5.0×104个/ μL。A375细胞悬液摇匀后注射250 μL于裸鼠右腋部皮下，待接种的瘤细胞成瘤并直径达到1.0 cm时，处死动物，剥离肿瘤块，用锐利刀片纵向均匀切成24份，分别转种于24只5周龄裸鼠右腋部皮下，以皮下结节长径超过0.5 cm为成瘤标准。转种后1周达到成瘤标准，然后进行治疗。

实验分为3组，每组8只：①空白对照组：瘤内注射0.1 mL PBS；②VEGF阴性质粒组：无关干扰联合放疗组，在瘤体内注射脂质体包裹的对照siRNA质粒20 μg；③VEGF阳性质粒组： siRNA-VEGF联合放疗组，瘤内注射脂质体包裹的siRNA-VEGF质粒20 μg。第1周予BJ-6型直线加速器照射瘤体局部4Gy，瘤体表面覆盖1cm厚凡士林纱布。每周质粒注射2次，共4次。

1.2.3 Western blot和免疫组织化学检测VEGF的表达：Western blot：收集肿瘤组织块，加入1 mL蛋白裂解液，研磨后12000 r/min离心，取上清，按照CBA蛋白定量试剂盒使用说明检测蛋白浓度。每管加入缓冲液，95 ℃煮沸5 min，蛋白样品用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，将蛋白电转到NC膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加相应的鼠抗兔VEGF一抗(稀释1000倍)4 ℃过夜，加入相应的偶联兔抗人VEGF二抗(稀释1000倍)2 h，用ECL发光法检测，成像系统分析条带灰度值，以目的条带与Actin条带的比值代表目的蛋白的相对表达水平。免疫组织化学：获取肿瘤组织，用4%多聚甲醛固定，常规包埋，制片。

1.2.4 肿瘤坏死面积测量：每周测量恶性肿瘤的长(a)宽(b)高(c)，以公式计算肿瘤体积=(a×b×c)π/6 mm3。肿瘤坏死面积：面积计算采用Image-Pro-Plus软件，首先选中肿瘤部位，软件自动获得面积所占像素数，根据比例尺获得的像素-长度比例(mm2/像素)将面积换算为绝对面积(mm2)。

2 结果

2.1 瘤内注射重组质粒对恶性黑色素瘤VEGF表达的影响 空白对照组移植瘤注射PBS和VEGF阴性质粒组2周后VEGF的表达没有显著影响，而VEGF阳性质粒组可以显著抑制移植瘤VEGF的表达(见图1A)。Western blot半定量分析表明(见图1B)，VEGF阳性质粒组明显抑制了VEGF蛋白的表达，蛋白表达量只有空白对照组的(12.66±1.57)%，差异有统计学意义(P<0.01)，表明pRNAT-U6.1-siRNA重组质粒对VEGF 蛋白的表达起到了抑制作用。见图1、图2。

图1 瘤内注射重组质粒对恶性黑色素瘤VEGF免疫组化(A)及Western blot(B)结果(n=8)Fig.1 Expression of immunohistochemical(A) and Western blot(B) of melanocarcinoma by tumor injected recombinant plasmid(n=8)

图2 瘤内注射重组质粒对恶性黑色素瘤VEGF表达百分率比较(n=8)**P<0.01，与空白对照组比较Fig.2 Comparison of expression percentage of melanocarcinoma by tumor injected recombinant plasmid(n=8)**P<0.01，compared with control group

2.2 瘤内注射si-VEGF重组质粒对恶性黑色素瘤放疗敏感性的影响 瘤内注射重组质粒，每周测量并计算恶性肿瘤的长(a)宽(b)高(c)，以公式肿瘤大小=(a×b×c)π/6 mm3。照射前移植瘤体积：空白对照组：(11.870±1.230)mm3；VEGF阴性质粒组：(11.770±1.030)mm3；VEGF阳性质粒组：(11.660±1.056)mm3，差异均无统计学意义。单纯给予siRNA-VEGF质粒2周后即可显著抑制肿瘤的生长，生长2周后移植瘤体积：空白对照组：(14.902±1.392)mm3；VEGF阴性质粒组：(16.528±1.461)mm3；VEGF阳性质粒组：(13.152±1.136)mm3；VEGF阳性质粒组低于空白对照组，(P<0.05)。VEGF阴性质粒组高于空白对照组(P<0.05)。见图3。

图3 瘤内注射si-VEGF对恶性黑色素瘤生长的作用(n=8)*P<0.05，与空白对照组比较Fig.3 Effect of si-VEGF intra-tumoral injection on the volume of melanoma (n=8)*P<0.05，compared with control group

注射质粒4次，并给予放射治疗后肿瘤体积计算同上，在照射后第2周肿瘤体积siRNA-VEGF组与对照组比较显著减少，第3次注射后移植瘤体积：空白对照组：(5.026±0.462)mm3；VEGF阴性质粒组：(6.549±0.469)mm3；VEGF阳性质粒组：(4.261±0.436)mm3； VEGF阳性质粒组低于VEGF阴性质粒组(P<0.01)；第4次注射后移植瘤体积：空白对照组：(4.102±0.248)mm3；VEGF阴性质粒组：(4.862±0.468)mm3；VEGF阳性质粒组：(2.654±0.363)mm3； VEGF阳性质粒组低于VEGF阴性质粒组(P<0.01)。见图4。

图4 瘤内注射si-VEGF重组质粒对放疗后恶性黑色素瘤大小的影响(n=8)**P<0.01，与VEGF阴性质粒组比较Fig.4 Effect of si-VEGF intra-tumoral injection on the volume of melanoma after radiation(n=8)**P<0.01,compared with VEGF negtive plasmid group

VEGF阳性质粒组与对照组比较，肿瘤坏死面积显著增加，空白对照组：(6.734±0.449)mm2；VEGF阴性质粒组：(5.243±0.584)mm2；VEGF阳性质粒组：(11.760±1.435)mm2；VEGF阳性质粒组大于空白对照组和VEGF阴性质粒组，(P<0.001)。见图5。

图5 瘤内注射si-VEGF重组质粒对恶性黑色素瘤坏死面积的影响(n=8)ΔΔΔP<0.001，与VEGF阳性质粒组比较Fig.5 Effect of si-VEGF intra-tumoral injection on the area of melanoma necrosis after radiation (n=8)ΔΔΔP<0.001，compared with VEGF positive plasmid group

3 讨论

恶性黑素瘤是由皮肤和其他器官黑素细胞产生的肿瘤，皮肤黑素瘤表现为色素性皮损在数月或数年中发生明显改变。其发病率虽低，但其恶性度高，转移发生早，死亡率高，因此早期诊断、早期治疗很重要。对早期未转移的病变应行根治性手术切除，应根据Breslow深度确定切除范围，如果是指(趾)恶性黑素瘤，可采用截指(趾)术。应切除受累淋巴结，但预防性淋巴结切除仍有争议。肢体动脉灌注抗有丝分裂药物治疗肢体黑素瘤有一定疗效。对于发生广泛转移者可采用联合化疗和放射治疗。生物化学治疗和分子靶向治疗具有很大的前景。

本实验研究结果得出，免疫组化与Western blot 均发现了pRNAT-U6.1-siRNA重组质粒对VEGF 蛋白的表达起到了抑制作用，进而抑制肿瘤的生长。通过使用BJ-6型直线加速器照射瘤体局部4Gy后，本研究发现VEGF抑制组肿瘤体积显著减少，提示了应用pRNAT-U6.1-siRNA重组质粒对肿瘤放疗敏感性的提高。目前已经有研究针对VEGF和VEGF受体下游酪氨酸激酶的小分子靶向抑制药物和阻断性单克隆抗体，取得了一定的效果[8]。然而这些治疗存在着半衰期短，潜在的全身性副作用等自身不足，限制了其临床应用。siRNA干扰技术是最新的基因阻断技术，由双链RNA介导、在转录后mRNA 水平关闭相应基因的表达，是序列特异性的转录后基因沉默，在某种程度上可以达到基因敲除的效果[9]。siRNA 干扰技术相对于传统的反义核酸、基因剔除等技术，具有严格序列特异性、治疗针对性强、级联放大效应等优点，故成为基因功能探索与治疗的全新研究手段，应用RNAi 技术抑制内外源性致病基因的表达正成为基因治疗的研究热点。目前国内外已有使用siRNA干扰技术基因沉默VEGF基因在卵巢癌、膀胱癌等肿瘤中的表达的相关研究报道[10-13]。结果表明，VEGF-siRNA抑制肿瘤细胞的增殖、诱导凋亡，但VEGF -siRNA是否能增加恶性黑色素瘤细胞放射敏感性的研究未见报道。

然而目前siRNA干扰技术仍然存在着一些问题，包括RNA干扰的序列选择、衰减现象、转染效率等等，因此单纯的RNAi阻断VEGF基因表达并不容易取得理想的肿瘤治疗效果。本实验研究仅限于裸鼠体内研究，而人体内微环境更加复杂，干扰因素更多，如何真正在人体内实现基因治疗及其放疗增敏机制还有待进一步研究。

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(编校：谭玲)

Effect of siRNA interfering vascular endothelial growth factor on radiation sensitization of malignant melanoma

PANG De-quan1, WANG Ying-man2, DAI Yun-fei1, BAI Jing3, ZHENG Wei-guo4, >GONG Feng-ling5, ZHAO Zhi-yu6

(1．Department of Radiotherapy, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 2.Department of Hematology, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 3.Department of Pharmacology, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 4.Department of Emergency, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 5.Department of Radiology, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China; 6.Department of Stomatology, The Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo investigate the role of a small RNA interference against VEGF in radiation sensitivity in melanoma.MethodsA375 human melanoma cell lines were transplanted into nude mice，which with malignant melanoma were randomly divided into control group, VEGF negative plasmid group and VEGF positive plasmid group, followed by 4Gy irradiation twice a week for 2 weeks. The volume of tumor was calculated twice a week， the area of tumor necrosis was assayed by HE，the expression of VEGF in tumor was determined by Western-blot and Immunohistochemical.ResultsThe expression of VEGF in VEGF positive plasmid group decreased significantly (P<0.05), VEGF positive group had more tissue necrosis, tumor growth was significantly inhibited (P<0.05).ConclusionsiRNA-VEGF in tumor injection liposome encapsulated in malignant melanoma has a role in the radiation sensitization, which provides an experimental basis for the clinical development of targeted therapy combined with radiotherapy for the treatment of VEGF gene.

vascular endothelial growth factor; siRNA; radiation sensitivity; malignant melanoma; apoptosis

唐山市科技局指令性计划(12140209A-30)；河北省科技厅 (112761175)

庞得全，博士，副主任医师，研究方向：肿瘤放射增敏及肿瘤分子生物学；肿瘤放射治疗和综合治疗，E-mail: pdq1974@aliyun.com。

R739.5

A

1005-1678(2015)08-0048-04