Dnmt1基因单核苷酸多态性与胃癌的关系

高燕 崔艳欣 姜相君

作者单位：266000 青岛 青岛市市立医院消化内二科

基础研究

Dnmt1基因单核苷酸多态性与胃癌的关系

高燕 崔艳欣 姜相君

作者单位：266000 青岛 青岛市市立医院消化内二科

目的探讨Dnmt1基因rs16999593、rs2228611位点单核苷酸多态性与胃癌发病易感性的关系。方法采用病例-对照的研究方法，采集青岛地区310例胃癌患者（胃癌组）与420名健康体检者（对照组）外周血液样本，提取基因组DNA，PCR扩增目的基因片段，用DNA直接测序法对Dnmt1基因rs16999593、rs2228611位点进行基因分型，分析其与胃癌发病易感性的关系。结果Dnmt1基因rs16999593位点TT型、CT型和CC型在胃癌组中的频率分别为58.1%、36.1%和5.8%，在对照组中分别为66.9%、27.9%和5.2%。与野生型TT型相比，携带CT基因型者胃癌发病的风险性增加（OR＝1.494，95%CI=1.086～2.057，P<0.05），CC基因型虽可增加胃癌发病风险，但差异无统计学意义（OR=1.277，95%CI=0.677～2.448，P>0.05）。rs2228611位点的各基因型在胃癌组和对照组间分布频率的差异无统计学意义（P>0.05）。结论Dnmt1基因rs16999593位点CT基因型可能增加青岛地区汉族人群胃癌发病的易感性。

胃肿瘤；Dnmt1基因；单核苷酸多态性；基因型；易感性

胃癌是消化系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，是全世界第四大常见恶性肿瘤，死亡率仅次于肺癌而位居第二位［1］。在我国，胃癌是继肺癌、乳腺癌之后的第三大常见恶性肿瘤，其死亡率在肺癌、肝癌之后，位居第三位［2］。胃癌的发生是一个复杂过程，涉及多因素、多基因、多步骤及其相互作用的结果，目前尚不能阐明胃癌的病因。Dnmt1是首个被克隆的真核生物C5胞嘧啶特异的DNA甲基转移酶，1988年由Bestor等［3］克隆出。Dnmt1基因定位于人染色体19p13.2-13.3，其cDNA全长为5 434 bp［4］。它是DNA甲基化过程的关键酶，抑癌基因的高甲基化与其异常表达有关，Dnmt1高表达改变了基因的甲基化模式，从而使抑癌基因沉默、原癌基因激活，最终导致肿瘤发生［5］。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是基因多态性的形式之一，主要指DNA序列中单个碱基的转换、颠换、插入或缺失，它是人类可遗传变异的主要形式，不同人群对某些疾病的易感性可能正是由SNPs造成。已有大量研究表明，Dnmt1基因与胃癌的发生密切相关，但是这些研究是针对DNA甲基化，目前有关Dnmt1 SNPs与胃癌关系的研究鲜见报道。本研究对青岛地区310例胃癌患者及420名健康对照者Dnmt1基因rs16999593、rs2228611位点进行检测，探讨其基因型与胃癌发病易感性的关系。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2013年7月至2014年12月在青岛市市立医院住院治疗的胃癌患者310例（胃癌组），患者均经胃镜或术后病理学确诊为胃癌，术前均未接受放化疗。男性228例，女性82例，平均年龄（60.3±8.8）岁。采用性别年龄匹配的原则，选取青岛市市立医院体检中心420名健康对照者（对照组），排除有胃部疾病及肿瘤家族史者，其中男性300名，女性120名，平均年龄（63.6±12.2）岁。所有研究对象均为青岛地区汉族人口。胃癌组与对照组之间在年龄、性别、吸烟与饮酒等方面的差异均无统计学意义（P>0.05），具可比性。采集血液标本均取得研究对象的知情同意，研究方案经青岛大学医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 抽取研究对象外周静脉血液2 ml，经EDTA抗凝，按TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提取基因组DNA，用紫外分光光度法检测DNA的浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的完整性，制备的DNA于-20℃保存。

1.2.2 PCR扩增目的基因片段 以NCBI基因序列数据库获得的Dnmt1基因rs16999593、rs2228611位点核苷酸序列为依据，设计其PCR引物。rs16999593位点引物序列：上游引物为5′-CAGTTCTCAGCATCCTA-GCC-3′，下游引物为5′-GGAATCATCTGCTCTTACGC-3′。rs2228611位点引物序列：上游引物为5′-CAAAAC-CAATCTATGATGACGACCC-3′，下游引物为5’-GG-CAGGCTCTTGCTATGTTG-3′。PCR反应体系：1μl DNA模板，10×PCR缓冲液2.5μl，50 mmol/L MgCl20.8μl，10 mmol/L dNTP混合液0.5μl，5μmol/L正反向引物各1μl，Platinum@Taq DNA聚合酶（Invitrogen公司）0.2μl，以灭菌蒸馏水补足至25μl。扩增反应在ABi9700 PCR仪（美国ABI公司）上进行，反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃终延伸5 min。取2μl的PCR产物，用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

1.2.3 DNA直接测序分析基因型 成功扩增目的基因片段后，加入POP-6胶（Applied BioSystems公司），应用ABI PRISMTM3700 DNA Analyzer进行测序。

1.3 统计学方法

用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理。通过Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验确认样本的群体代表性，应用χ2检验分析基因型频率的分布是否符合H-W平衡，P>0.05表明研究对象具有群体代表性。采用χ2检验确定胃癌组与对照组之间两个位点基因型频数分布的差异以及胃癌组与对照组之间年龄、性别等基本情况的频数分布差异有无统计学意义，以OR及95%CI表示相对危险度。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H-W遗传平衡检验

对照组rs16999593、rs2228611位点基因型实际值与期望值频数差异无统计学意义（P>0.05），符合遗传平衡，具有群体代表性。见表1。

表1 H-W遗传平衡检验结果（n）

2.2 Dnmt1基因rs16999593、rs2228611位点各基因型与胃癌易感性的关系

图1 Dnmt1基因rs16999593位点CT型、CC型测序图

Dnmt1基因rs16999593位点CT型、CC型测序结果见图1A、图1B。与野生型TT型相比，CT基因型者胃癌发病的风险性增加，差异有统计学意义（OR＝1.494，95% CI=1.086～2.057，P<0.05），即携带Dnmt1基因rs16999593位点CT基因型的个体罹患胃癌风险是携带TT型个体的1.494倍。CC基因型虽可增加胃癌的发病风险，但差异无统计学意义（OR=1.277，95%CI=0.677～2.448， P>0.05）。见表2。Dnmt1基因rs2228611位点AG型、AA型测序结果见图2A、图2B。与野生型GG型相比，AG型可增加胃癌发生风险，但差异均无统计学意义（OR＝1.091，95%CI＝0.804～1.480，P>0.05）。AA型虽可降低胃癌患病风险，但差异亦无统计学意义（OR＝0.843，95%CI＝0.426～1.629，P>0.05）。rs2228611的各基因型在胃癌组及对照组间的分布频率差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

图2 Dnmt1基因rs2228611位点AG型、AA型测序图

3 讨论

胃癌的发生与其相关的癌基因激活及抑癌基因失活有关，其机制涉及遗传学及表观遗传学的改变［6］。表观遗传学改变是目前研究的热点，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑和非编码RNA调控，其中研究最深入的当属DNA甲基化。基因单核苷酸多态性与胃癌的关系也是目前研究的热点之一。笔者之前研究发现PSCA基因rs2976392位点AA基因型与中国汉族人群的胃癌发病有关［7］。最近有研究表明SNPs与DNA甲基化关系密切［8］，SNPs可能通过对甲基化相关酶基因的影响调控其甲基化状态［9］。Dnmt1是催化DNA甲基化的主要酶之一，主要作用于半甲基化的DNA，是维持已经存在的甲基化状态所必需的。

研究表明，Dnmt1的SNPs与多种疾病的发生、发展相关。Chang等［10］采用病例-对照方法，对218例食管癌患者及415名健康对照者进行研究，发现Dnmt1 rs2228612与中国江苏地区食管癌的发生密切相关，携带G等位基因可以降低食管癌的发病风险。Kullmann等［11］的研究表明，Dnmt1基因rs2228612 GG（突变）基因型可以降低白种人女性乳腺癌的发病风险，GG基因型可能是乳腺癌发病的一个保护因素。我国也有学者研究了Dnmt1基因单核苷酸多态性与乳腺癌发病的关系。Xiang等［12］学者的研究发现，Dnmt1基因rs16999593 CT杂合基因型及C等位基因在浸润性乳腺导管癌患者中出现的频率低于正常对照组，由此推断它们可能是浸润性乳腺导管癌发生过程中的一个保护因素，而rs2228611 AG基因型在浸润性乳腺导管癌患者中出现的频率低于正常对照组，可能是浸润性乳腺导管癌发生过程中的一个危险因素。Dnmt1的SNPs还可以作为预测幽门螺杆菌感染基因易感性及发展为胃黏膜萎缩危险性的基因标志物。Jiang等［13］的研究发现，携带Dnmt1 rs10420321 GG基因型（OR＝0.68，95%CI：0.52～0.89）和rs8111085CC基因型（OR＝0.67，95%CI：0.51～0.87）的个体，其幽门螺杆菌的感染危险性降低，但这两个基因型发展为胃黏膜萎缩的危险性增加。

本研究探讨了Dnmt1基因rs16999593、rs2228611位点单核苷酸多态性与胃癌遗传易感性的关系。目前关于Dnmt1基因单核苷酸多态性与胃癌易感性的研究较少，且结论也不尽相同。本实验研究表明Dnmt1基因rs16999593位点单核苷酸多态性与青岛地区汉族人群胃癌易感性相关，CT基因型可以显著增加胃癌的发病风险，携带该基因是胃癌发生的一个危险因素，这与Yang等［14］对中国南方地区的研究结论一致。但Khatami等［15］的研究并未发现伊朗人群Dnmt1基因单核苷酸多态性（rs721186、rs13784、rs2228611）与胃癌易感性有关，这表明基因多态性可能与不同地区、不同国家及种族差异有关。除此之外，还有学者［16］探讨了Dnmt1基因单核甘酸多态性对胃癌患者术后生存时间的影响。结果发现在中国北方汉族人群中，Dnmt1基因rs2228611位点，携带GA/AA型突变型基因的胃癌患者术后生存时间延长，这表明GA/AA型是胃癌预后的保护因素，可以作为预测胃癌预后的生物标志物。

本研究亦有一定局限性。首先，胃癌的发生是一个多基因参与、环境与遗传因素相互作用的结果，不能仅凭借分析单个基因来确定胃癌发生的风险性；其次，所用样本相对较少，代表性相对有限，进一步探讨Dnmt1单核苷酸多态性与胃癌易感性的关系以及有关位点单核苷酸多态性与胃癌预后的关系，还需要大样本量、多因素分层实验来验证，有关方面尚待深入研究。

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［2015-06-26收稿］［2015-08-25修回］［编辑 阮萃才］

Association of Dnmt1 single-nucleotide polymorphisms and risk of gastric cancer

Gao Yan，Cui Yanxin，Jiang Xiangjun（Department of Gastroenterology，Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266000，P.R.China）

Jiang Xiangjuni.E-mail：drjxj@163.com

ObjectiveThe aim of our study was to investigate whether single-nucleotide polymorphisms at loci rs16999593 and rs2228611 in the gene encoding DNA methyltransferase 1（Dnmt1）are associated with risk of gastric cancer.MethodsA total of 310 patients with gastric cancer and 420 healthy controls，all Han Chinese，were genotyped at rs16999593 and rs2228611 using PCR-based DNA sequence analysis and direct DNA sequencing.ResultsTT，CT and CC genotypes were identified at the rs16999593 locus:respective frequencies among patients were 58.1%，36.1%and 5.8%，compared to 66.9%，27.9%and 5.2%among controls.The CT genotype was associated with significantly higher risk than the wild-type TT genotype（OR 1.494，95%CI 1.086 to 2.057，P<0.05）.The CC genotype was associated with marginally，but not significantly，higher risk than TT（OR 1.277，95%CI 0.677 to 2.448，P>0.05）.The frequencies of genotypes at rs2228611 did not differ significantly between patients and controls（P>0.05）.ConclusionPolymorphism at Dnmt1 rs16999593 is associated with elevated risk of gastric cancer among Han Chinese in Qingdao.

Gastric neoplasm；Dnmt1 gene；Single-nucleotide polymorphisms；Genotype；Susceptibility

R735.2

A

1674-5671（2015）06-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.06.02

青岛市公共领域科技支撑计划项目（2012-1-3-1-（10）-nsh）

姜相君。E-mail：drjxj@163.com