复方化浊润燥降气方对小鼠食管癌癌前病变的干预作用

范焕芳单保恩韩长辉

作者单位：050011 石家庄1河北省中医院肿瘤二科；050041 石家庄2河北医科大学第四医院科研中心

基础研究

复方化浊润燥降气方对小鼠食管癌癌前病变的干预作用

范焕芳1单保恩2韩长辉1

作者单位：050011 石家庄1河北省中医院肿瘤二科；050041 石家庄2河北医科大学第四医院科研中心

目的观察复方化浊润燥降气方对小鼠食管癌癌前病变的干预作用。方法130只小鼠分为正常组、模型组、阳性对照组、中药预防组（简称“预防组”）、中药治疗组（简称“治疗组”），采用4-硝基喹啉-氧化物（4-NQO）制备小鼠食管癌癌前病变模型，用中药复方化浊润燥降气方进行干预，于用药第14周末及实验结束时用光镜、电镜观察各组小鼠食管上皮组织病理形态学变化。结果模型组第14周末光镜下见小鼠上皮细胞体积增大，数量增多，细胞核增大，证实小鼠食管癌癌前病变模型制备成功。实验结束时癌变形成，各组癌变率正常组为0，模型组为80%、阳性对照组为21.4%、预防组为5.6%、治疗组为12.5%。电镜下见模型组细胞间隙增宽，桥粒减少，核固缩，染色质边移。光镜和电镜下均示阳性对照组、预防组、治疗组病理改变减轻。结论复方化浊润燥降气方能减轻小鼠食管癌前病变损害程度，对预防食管癌有一定作用。

食管肿瘤；食管癌癌前病变；复方化浊润燥降气方；病理形态学；干预

食管癌是我国常见恶性肿瘤之一，5年生存率仅为20%～30%，死亡率居恶性肿瘤的第四位［1］。大多数食管癌确诊时已失去手术机会。因此，对晚期食管癌的治疗只能采用放疗、化疗相结合的综合治疗模式［2，3］。食管癌的发生、发展经历了不典型增生到癌变的复杂过程，所以防治癌前病变是降低食管癌发病率和死亡率的主要措施［4］。目前，对食管癌及食管癌癌前病变的研究多数局限于体外细胞培养和临床标本检测水平［5，6］。体外细胞培养不能模拟体内复杂的多细胞、多信号的调节过程，患者手术后标本检测也只能采集到手术时的肿瘤标本，难以反映整个疾病的发生、发展过程［7］。

本实验采用4-硝基喹啉-氧化物（4-NQO）制备小鼠食管癌癌前病变模型，用中药复方化浊润燥降气方进行预防及治疗，观察诱癌不同时期各组小鼠食管上皮组织细胞病理形态学变化情况和该方剂对小鼠食管癌癌前病变的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取清洁级健康SPF级C57BL/6小鼠130只，雌雄各半，4周龄，体重17～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 药物制备

造模药物4-NQO（购自美国Sigma公司）：将4-NQO 1 g溶于50 ml蒸馏水，配成2%的稀释液，4℃冰箱避光保存。使用时取2%原液0.5ml加入100ml饮用水中，配成100μg/ml。小鼠4-NQO用量为25 mg/（kg·d）。阳性对照组药物ATRA（购自美国Sigma公司）：使用时将ATRA 30 mg溶于20 ml稀释后的甲基纤维素中，小鼠每次灌胃剂量为7.5 mg/kg，每周3次。

1.3 复方化浊润燥降气方

药物组成：丹参、沙参、郁金、砂仁、荷叶、茯苓、浙贝母、藿香、佩兰、冬凌草、全蝎。由河北省中医院药学部提供，每付中药生药含量131 g，免煎颗粒为13.7 g，小鼠用量与人用量的比例为0.0026∶1，20 g小鼠的中药免煎剂量为0.036 g，即小鼠免煎颗粒用量为1.8 g/kg。

1.4 主要仪器和试剂

病理组织包埋机（BM.II型）、组织切片机（LEICA RM23 15型）、图像采集系统（Qcapture）、透射电子显微镜H-7500等。电镜检测试剂：4%戊二醛固定液、磷酸缓冲液、1%四氧化锇（OsO4）、50%丙酮、70%丙酮、80%丙酮、90%丙酮、100%丙酮、醋酸双氧铀、枸橼酸铅等。

1.5 实验方法

将130只小鼠置于恒温18～25℃、湿度为30%～ 50%的环境中，用经高压灭菌的清洁级动物饲料和水适应性喂养3 d，开始后续实验。

1.5.1 动物模型制备及其实验 随机将130只小鼠分为正常组20只、模型组30只、阳性对照组20只、中药预防组30只（简称“预防组”）、中药治疗组30只（简称“治疗组”）。各组雌雄小鼠数无明显差异，雌雄分笼。正常组常规饲养，不做特殊处理。其余110只小鼠，每日饮用100μg/ml的4-NQO水溶液，正常喂养饲料。预防组在开始造模的同时给予复方化浊润燥降气方灌胃，每周3次，浓缩中药免煎颗粒剂量为1.8 g/kg。各组小鼠在给药期间每周测体重1次，在用药第10周末、第12周末、第14周末模型组分别麻醉2只小鼠，取食管组织，行HE染色，观察病理形态学变化，当出现食管中度不典型增生时为诱导食管癌癌前病变模型成功的时间。第14周末模型组2只小鼠食管上皮发生中度不典型增生，此时将正常组及预防组各5只、模型组3只小鼠进行麻醉，肉眼大体观察，并行HE染色，证实模型组癌前病变建模成功。小鼠停用4-NQO水溶液。之后模型组常规饲养；阳性对照组小鼠开始给予ATRA，剂量为每只7.5 mg/kg，每周3次；预防组小鼠继续给予复方化浊润燥降气方灌胃，剂量如前；治疗组小鼠在模型制备成功时开始给予复方化浊润燥降气方灌胃，用量同预防组。第20周、第22周末各组分别取小鼠2只，第24周末取3只小鼠麻醉，取食管标本，肉眼观察并行HE染色。发现第22周末模型组1只小鼠食管上皮组织癌变，第24周末模型组3只小鼠食管上皮均有癌变，遂全部处死小鼠，取食管标本，进行各组指标检测。

1.5.2 肉眼观察各组小鼠食管黏膜变化情况 将小鼠食管纵形剖开，平铺于操作台上，参考林培中等［8］提供的方法，肉眼观察并记录小鼠食管上皮大体变化（光滑、粗糙、白斑形成、乳头状瘤）及肿瘤发生情况。

1.5.3 光镜下观察食管上皮病理组织学变化 取小鼠食管切成纵条组织，用中性福尔马林固定，常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察食管病理组织学变化。癌前病变的判断参照文献［9］分为4级，0级：正常食管鳞状上皮，无变化；Ⅰ级（增生性病变）：分为基底细胞增生、单纯性增生和乳头状增生；Ⅱ级（癌前病变）：分为上皮细胞不典型增生、上皮早期浸润、乳头状瘤；Ⅲ级（癌）：分为原位癌、早期癌和乳头状瘤癌变。

1.5.4 电子显微镜观察食管上皮超微结构的变化 将模型组、预防组、治疗组小鼠食管组织用4%戊二醛及1%饿酸双重固定和Epon812包埋，超薄切片。常规铀-铅染色，透射电镜观察并摄像。

2 结果

2.1 小鼠一般状况观察

实验2周后个别造模小鼠开始出现精神差，颈部脱毛，实验第10周末模型组、治疗组、阳性对照组小鼠开始皮毛蓬松；预防组精神状态较模型组、治疗组、阳性对照组好。实验过程中治疗组小鼠死亡2只，预防组死亡3只，阳性对照组死亡2只，模型组死亡2只，均因精神差，衰竭而死亡。实验结束时各组存活小鼠正常组11只、模型组15只、阳性对照组14只、预防组18只、治疗组24只。

2.2 各组小鼠食管标本的大体观察

正常组小鼠食管上皮黏膜表面光滑，在整个实验过程中未发现食管病变；模型组小鼠在第14周末食管黏膜充血、变红色或色泽变灰暗，表面增厚、发白及粗糙。黏膜表面出现点状、圆形、卵圆形或条状的白色斑块，表现为上皮不典型增生灶。预防组小鼠第14周末食管黏膜色泽灰暗较模型组轻，食管表面增厚、发白、粗糙，但比模型组轻。

实验结束时，模型组小鼠食管上皮出现单发或多发乳头状瘤，呈卵圆形、半球形或丘状突起，乳头状瘤所在食管部位出现纺锤样扩张，表面有溃疡形成，提示出现癌变。阳性对照组、治疗组、预防组小鼠出现单发或多发乳头状瘤，呈卵圆形、半球形或丘状突起，黏膜表面见点状、圆形、条状白色斑块；阳性对照组、治疗组食管表面无溃疡形成。预防组2只小鼠食管表面可见溃疡形成，HE染色未见癌变，考虑与多次中药灌胃，灌胃器反复刺激食管导致食管受损有关。

2.3 各组小鼠食管组织病理学光镜观察结果

2.3.1 正常组 实验过程中未见食管上皮增生灶。

2.3.2 模型组 第14周末，小鼠食管上皮呈癌前病变表现：上皮增厚，基底细胞增生活跃，层次较多，可超过上皮全层的2/3，细胞体积增大，数量增多，细胞核增大，染色质加深，并可见双核细胞（图1）。实验结束时，小鼠食管上皮增厚明显，基底细胞增生多层，有些区域增生的基底细胞向固有膜突出，在乳头状瘤的个别乳头或瘤的基部，细胞肿大，核大小不等，核分裂相增多，细胞排列紊乱，部分癌细胞位于上皮的固有膜内，或已侵入黏膜下层。见图2。

2.3.3 阳性对照组 实验结束时，小鼠食管上皮增厚，基底细胞层增生活跃，细胞体积增大，数量增多，细胞核增大，染色质加深。有些区域增生的基底细胞向固有膜突出，个别有小乳头状瘤形成。见图2。

图1 第14周末光镜下食管上皮组织病理形态学变化（×400）

图2 实验结束时光镜下各组食管上皮组织病理形态学变化（×400）

2.3.4 预防组 第14周末，小鼠食管上皮HE染色表现为上皮增厚，基底细胞排列尚整齐，不超过上皮全层的1/3，细胞体积较大，细胞数量增多，细胞核增大，染色质加深。实验结束时，小鼠食管上皮增厚，基底细胞增生，基底细胞肿大，细胞核增大，形态不一致，排列不整齐，核染色质加深，可见双核细胞或多核细胞。见图1、图2。与同期模型组、治疗组相比，小鼠食管上皮增生的程度明显减轻。

2.3.5 治疗组 实验结束时，小鼠食管上皮增厚，基底细胞层不规整，细胞体积增大，细胞数量增多，细胞核增大，染色质加深，个别细胞可见核仁，并可见外突型乳头状增生，基底细胞增生增多并向表面突出，形成具有间质的单个乳头，可见癌细胞。见图2。

2.4 实验结束时各组小鼠食管癌及癌前病变发生率

实验结束时，正常组11只小鼠无食管癌及癌前病变发生。模型组发生癌变率为80%（12/15）；阳性对照组3只（21.4%）、预防组1只（5.6%）和治疗组3只（12.5%）发生癌变。

2.5 各组小鼠食管上皮组织细胞电镜观察结果（见图3）。

图3 实验结束时透射电镜下食管上皮组织病理形态学变化（×12 000）

2.5.1 模型组 细胞间隙增宽，桥粒减少，桥粒连接破坏，可见细胞间突起，线粒体空泡及嵴和膜的融合消失，可见溶酶体、游离核糖体及张力微丝，内质网扩张，核固缩，核周隙扩张，染色质边移。

2.5.2 阳性对照组 细胞间隙正常，可见大量桥粒，细胞质及细胞核内可见少量大小不等、膜包绕、均质、高电子密度的圆形致密物，线粒体空泡及嵴和膜的融合消失，内质网扩张，可见张力微丝及游离核糖体，核形不规则，可见切迹，未见核仁。

2.5.3 预防组 细胞间隙紧密，可见桥粒连接，细胞质及细胞核内可见少量大小不等、膜包绕、均质、高电子密度的圆形致密物，线粒体空泡及嵴和膜的融合消失，可见张力微丝及游离核糖体，核形规则。

2.5.4 治疗组 细胞间隙增宽，桥粒减少，桥粒连接松散，可见细胞间突起，部分线粒体空泡及嵴和膜的融合消失，可见溶酶体、游离核糖体及张力微丝，内质网扩张，核周隙扩张，染色质边移。

以上各组小鼠食管上皮组织细胞超微结构的改变与光镜下所见的食管增生病变程度一致。

3 讨论

食管癌的发生、发展过程由正常鳞状上皮→基底细胞增生→异型增生→原位癌→侵袭性鳞状细胞癌。食管上皮不典型增生为食管癌癌前病变，与食管癌的发生密切相关。因此，研究食管上皮不典型增生的发展过程对于了解食管癌发生和防治具有重要意义。早在1963年，中科院院士杨简教授深入我国食管癌高发区河南省林县等地开展食管癌病因学调查，并用多环碳氢化合物首先建立小鼠食管癌模型，用亚硝胺诱发食管癌与癌前病变，深入观察了大鼠、小鼠实验性食管癌的病理形态学及组织发生学，为研究食管癌癌前病变的病理形态学变化奠定了实验基础。

在食管癌研究中，多数实验动物模型是用大白鼠进行实验。近年研究表明，小鼠与人类在遗传学、病理学、生物学许多特性方面相似［10］，因此，小鼠是目前基础和临床用于肿瘤研究的主要动物。虽然NMBA在大鼠模型中的食管癌诱导成功率非常高，但NMBA诱导小鼠食管癌癌前病变却未取得成功。2004年Tang等［11］报道了采用4-NQO诱导小鼠食管癌癌前病变成功率高，且4-NQO作用后诱发的口腔-食管鳞癌模型显示了多级非典型增生、癌前病变和癌性病变等特点。故本实验采用4-NQO制备小鼠食管癌癌前病变的动物模型。

本实验第14周对小鼠食管上皮组织行病理学检测，结果显示，预防组小鼠食管上皮组织HE染色表现为食管上皮增厚，基底细胞增生活跃，但细胞排列尚整齐，未超过上皮全层的1/3，提示病理改变是从基底细胞活跃到上皮增生的过程，此时模型组基底细胞增生活跃，超过上皮全层的2/3，细胞体积增大，细胞数量增多，细胞核增大，可见双核细胞，并有乳头状瘤形成，提示食管癌癌前病变模型制作成功。电镜观察也证明了这一结果。焦炳忠等［12］报道采用透射电镜和扫描电镜观察小鼠食管的超微结构改变，发现鳞状上皮不典型增生细胞的表面形态及微嵴等改变与人的食管鳞状上皮不典型增生的细胞改变较为相似。

本实验用于预防小鼠食管癌的药物为中药复方化浊润燥降气方。此方是在启膈散的基础上加化浊通络解毒之品而成，其中丹参、沙参、郁金、砂仁、荷叶、茯苓、贝母为启膈散的主要组份。启膈散出自清代医家程钟龄（国彭）所著之《医学心悟》一书。原方为治疗中医“噎膈”所设。食管鳞状上皮不典型增生为食管癌癌前病变，其临床表现与食管癌基本相同。食管癌癌前病变亦属“噎膈”范畴，乃噎膈早期病证［13］。启膈散具有润燥降气、开郁化痰的作用，所针对的正是噎膈轻症患者。方中加用藿香、佩兰、冬凌草、天龙、全蝎化浊解毒通络，共奏化浊解毒、化痰解郁、通络散结之效。ATRA对食管癌细胞EC109具有明显抑制作用，并可诱导细胞分化，故本实验将其作为阳性对照药物。

食管上皮不典型增生、乳头状瘤均属于食管癌前病变阶段，在此阶段采用合理药物治疗能在一定程度上阻断食管癌前病变的进程，甚至逆转部分不典型增生向正常转化。本研究结果表明，阳性对照组、预防组、治疗组小鼠食管上皮病理损害程度较模型组明显减轻，预防组优于治疗组，提示在癌前病变阶段不采用药物干预，其病理损害将进行性发展，导致食管癌的发生。如果及早采用药物干预或预防用药可以减轻食管癌癌前病变的病理损害，在一定程度上阻断食管癌癌前病变的进程。本实验结果表明，复方化浊润燥降气方能减轻小鼠食管癌癌前病变的损害程度，对预防食管癌癌前病变有一定作用，有关方面值得深入研究。

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［2015-04-08收稿］［2015-09-28修回］［编辑 江德吉］

Effects of Fufang Huazhuo Jiangqi on precancerous lesions of the esophagus in a mouse model

Fan Huanfang1，Shan Bao′en2，Han Changhui1（1The Second Oncology，TCM Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050011，P.R.China；2Scientific Research Center，Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050041，P.R.China）

Shan Bao′en.E-mail：keshi3456@163.com

ObjectiveTo observe the effects of the Fufang Huazhuo Jiangqi traditional Chinese medicine preparation on a mouse model of precancerous esophageal lesions.MethodsMice were treated with 4-nitro quinoline-oxide（4-NQO）to induce formation of precancerous esophageal lesions，and the animals were distributed into normal group，model group，positive control group，prevention group，treatment group Esophageal epithelial tissue morphology was examined by light microscopy at 14 weeks of treatment，and by electron microscopy at the end of the experiment.ResultsThe model group showed greater cell volume，cell number，and nuclear size at 14 weeks，confirming the successful induction of precancerous esophageal lesions.Malignant transformation occurred in none of the animals in the normal group，80%of animals in the model group，21.4%in the positive control group，5.6%in the prevention group，and 12.5%in the treatment group.At the end of the experiment，animals in the model group showed intercellular broadening，desmosomes，nuclear pycnosis，and chromatin edges.Fewer pathological changes were observed in the positive control，prevention and treatment groups.ConclusionThe Fufang Huazhuo Jiangqi prescription may significantly protect against malignant transformation of precancerous esophageal injury in a mouse model.It may therefore be useful for preventing esophageal carcinoma in humans.

Esophageal neoplasm；Esophageal precancerous；Fufang Huazhuo Jiangqi prescription；pathomorphology；Intervention

R735.1

A

1674-5671（2015）06-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.06.01

河北省高层次人才资助项目（B2012003007）

单保恩。E-mail：keshi3456@163.com