类叶升麻苷对谷氨酸损伤PC12细胞的保护作用*

彭晓明，霍仕霞，高莉，何燕，闫明

(1.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐 830049；2.石河子大学药学院，石河子 832003)

类叶升麻苷对谷氨酸损伤PC12细胞的保护作用*

彭晓明1，霍仕霞1，高莉1，何燕2，闫明1

(1.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐 830049；2.石河子大学药学院，石河子 832003)

目的 研究类叶升麻苷对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的影响。方法 将PC12细胞分为正常对照组、模型对照组、阳性药组和类叶升麻苷给药组。除正常对照组外，其余各组均以1.5 mmol·L-1谷氨酸处理24 h，再分别以10 μmol·L-1维生素E 和15.625，31.25，62.5，125，250 μmol·L-1类叶升麻苷作用。通过倒置显微镜观察细胞形态，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率，酶标法试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸(TBA)法试剂盒测定丙二醛(MDA)含量，WST[2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2氢-四唑盐,二钠盐]法试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，酶联免疫吸附法(ELISA)检测胞内活性氧(ROS)含量。结果 与模型对照组比较，除类叶升麻苷Ⅰ组(15.625 μmol·L-1AS)以外，其余各类叶升麻苷给药组均可明显改善PC12细胞形态，提高细胞存活率和SOD酶活性(P<0.01)，抑制LDH活性及MDA和ROS生成(P<0.01或P<0.01)。结论 类叶升麻苷对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤具有保护作用。

类叶升麻苷；谷氨酸；PC12细胞；损伤；保护作用

谷氨酸是哺乳动物脑内含量最高的氨基酸，其作为中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，不仅参与突触传递，还具有神经毒性[1-2]。目前研究表明[3]，谷氨酸是引起神经退行性疾病——阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的重要因素。谷氨酸在脑内过度释放可使神经细胞内钙离子(Ca2+)和氧自由基升高，诱发成对螺旋样细丝(paired helical filaments，PHF)形成，最终导致大量神经元死亡[4]。因此，研究安全有效的谷氨酸神经毒性阻断药物，是临床神经科学急需解决的问题。类叶升麻苷(acteoside，AS)是传统补益中药肉苁蓉中的苯乙醇苷类活性成分。既往研究表明[5-7]，AS对D-半乳糖所致的小鼠AD样模型、东莨菪碱所致的小鼠学习记忆障碍模型，以及过氧化氢(H2O2)诱导的PC12细胞氧化损伤模型均具有明显改善作用。以上研究结果提示，AS在防治AD方面具有潜在应用价值。笔者在本实验中通过谷氨酸诱导PC12细胞损伤，研究AS对PC12细胞的保护作用，以期为该药治疗AD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 AS由新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所制备(批号：20130401)，其化学结构经磁共振波谱法和质谱法确认，高效液相色谱(HPLC)面积归一化法鉴定含量>90%；RPMI-1640培养液为GIBCO产品(批号：1181347)；胎牛血清为Hyclone产品(批号：NXA0547)。氨苄西林钠(批号：119A035，含量≥98%)和硫酸链霉素(批号：423A058，含量≥98%)购自Solarbio公司。丙酮酸钠购自天津市光复精细化工研究所(批号：20071022，含量≥99%)。谷氨酸(含量≥99%)为上海源叶生物科技有限公司产品(批号：YY10038)。Rat ROS Elisa Kit购自R&D公司(批号：201311)。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测定试剂盒(批号：20131202)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒(批号：20131202)、微量丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(批号：20131130)、二辛可宁酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白含量测定试剂盒(批号：20131204)均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器 超净工作台(苏净安泰，型号：SW-CJ-1F)，倒置显微镜(上海光学六厂，型号：37XB)，二氧化碳(CO2)培养箱(Sanyo，型号：MCO-18AIC)，酶标仪(Thermo Fisher，型号：Multiskan Go 1510)。

1.3 细胞的培养 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞系(高分化)购自中国科学院细胞库。将PC12细胞以5×105个·mL-1接种于含10 %胎牛血清、0.11 g·L-1丙酮酸钠、2.5 g·L-1葡萄糖、1.5 g·L-1碳酸氢钠(NaHCO3)、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃，5 %CO2培养箱培养，每隔3 d换液1次。

1.4 细胞损伤模型的建立及给药 当培养瓶中PC12细胞融合率达到约80 %时，用含10 %胎牛血清的RPMI 1640培养液吹打下来，调节细胞密度至5×104个·mL-1，以每孔100 μL铺至96孔培养板。细胞培养48 h后，分别设定8组：①正常对照组(N组，无血清RPMI-1640培养液)；②模型对照组(M组，无血清RPMI-1640培养液)；③阳性药组(C组，10 μmol·L-1维生素E)；④AS Ⅰ组(15.625 μmol·L-1AS溶液)；⑤AS Ⅱ组(31.25 μmol·L-1AS溶液)；⑥AS Ⅲ组(62.5 μmol·L-1AS溶液)；⑦AS Ⅳ组(125 μmol·L-1AS溶液)；⑧AS Ⅴ组(250 μmol·L-1AS溶液)。除N组外，其余各组均用1.5 mmol·L-1谷氨酸诱导24 h，吸弃培养液，给予上述药物处理。各组细胞继续培养24 h后，倒置显微镜下观察形态并摄像。

1.5 噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法测定细胞存活率 将细胞接种于96孔培养板，培养48 h，经“1.4”项方法处理后加入MTT，继续培养4 h，吸弃培养液，加入二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)震荡溶解，于Multiskan Go 1510酶标仪测定490 nm处吸光度值(A值)，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=A给药/A正常×100%，N组细胞存活率记作100%。

1.6 细胞上清液中生化指标测定 将“1.4”项各组细胞与药物共培养24 h后，分别收集培养上清液40 μL，根据说明书测定细胞培养液中LDH活性、MDA含量和SOD活性。

1.7 细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)测定 将细胞按“1.4”项处理，吸弃培养上清液，加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS，pH 7.2～7.4)50 μL，于-80 ℃冰箱反复冻融，以使细胞裂解。然后2 000 r·min-1(r=13.5 cm)离心15 min，收集上清液用于测定蛋白浓度及ROS含量。ROS测定方法：参照试剂盒说明书，稀释标准品并在酶标包被板上设定标准孔15孔，空白孔3孔。在酶联免疫吸附(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)板的空白孔和测定孔中分别加入样品稀释液40 μL，吸取测定样品10 μL加入待测孔。封板膜封板置于37 ℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。然后每孔加入酶标试剂50 μL(空白孔除外)。 37 ℃温育30 min、洗涤液洗涤5次，拍干。每孔加入显色剂A和显色剂B各50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，450 nm测定A值。之后以标准品浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线并计算线性回归方程。由线性回归方程得出测定样品中的ROS浓度(C)，然后计算样品中实际ROS浓度。样品中实际ROS浓度=C(U·mL-1)×稀释倍数/待测样本蛋白浓度(mg·mL-1)。

2 结果

2.1 AS对PC12细胞损伤后形态的影响 见图1。N组PC12细胞轮廓层次较分明，立体感及折光性较强，突触明显且较多，数量也较多。M组细胞轮廓层次较差，神经元胞体表面粗糙，且细胞突触减少。与N组比较，15.625 μmol·L-1AS作用后细胞无明显改善，其余AS给药组PC12细胞立体感、折光性增强，细胞突触增多并交织成网状，胞质内颗粒物减少，退化死亡的PC12细胞明显减少，提示AS在31.25 ～ 250 μmol·L-1浓度范围内对PC12细胞具有保护作用。

2.2 AS对PC12细胞存活率、ROS、LDH、MDA和SOD的影响 见表1。1.5 mmol·L-1谷氨酸诱导PC12细胞24 h后，细胞存活率和SOD活性明显降低，ROS含量、LDH活性和MDA含量显著升高，表明谷氨酸致PC12细胞损伤模型诱导成功。与M组比较，ASⅠ组PC12细胞存活率、ROS、LDH、MDA和SOD等无明显改变，其他AS给药组PC12细胞存活率和SOD活性显著提高(P<0.01)，LDH活性和ROS、MDA的生成被抑制(P<0.05，P<0.01)，且随着给药浓度的增大，保护作用越强。

3 讨论

AD作为中枢神经系统退行性疾病之一，是继心血管病、脑血管病和恶性肿瘤之后老年人致死的重要诱因。目前其发病机制主要有胆碱能学说、β-淀粉样蛋白假说、Tau蛋白假说、神经血管假说、氧化应激学说等[8]。近年来越来越多的证据表明[9-10]，兴奋性氨基酸毒性与AD的发生、发展关系极其密切。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统最重要的兴奋性神经递质，参与中枢兴奋性突触传递。其介导的信号转导，构成记忆和认知的基础。当脑内多余的谷氨酸过度激活谷氨酸受体时，Na+、Ca2+大量内流，引起细胞内外离子失衡，造成大量神经元死亡。研究资料已证实[11]，对谷氨酸的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体进行持续刺激，可产生神经毒性效应。PC12细胞膜上存在大量NMDA受体。在神经生长因子(nerve growth factor，NGF)作用下，其与交感神经细胞的形态、结构和功能类似，成为近年来医学工作者研究神经细胞递质合成、储存和释放，以及离子通道及受体的细胞模型。因此本研究利用不同浓度AS作用于谷氨酸诱导损伤后的PC12细胞，从兴奋性氨基酸的神经毒性方面研究AS对AD的治疗作用。结果表明，AS能显著改善谷氨酸诱导损伤后的PC12细胞存活率及细胞形态。神经元胞体特征由最初的表面粗糙、细胞突触和细胞数量减少，逐渐转变为立体感、折光性增强，细胞突触增多。

A.N组；B.M组；C.C组； D.ASⅠ组； E.ASⅡ组；F.ASⅢ组；G.ASⅣ组； H.ASⅤ组

与N组比较，*1P<0.01；与M组比较，*2P<0.01，*3P<0.05

Compared with group N，*1P<0.01；Compared with group M，*2P<0.01，*3P<0.05

LDH是细胞内的标志酶，通常情况下细胞内漏出量很少。但细胞受损后，LDH由胞内渗漏至胞外。因此，测定细胞上清液中的LDH活性能够客观衡量细胞损伤或死亡程度[7]。ROS是以自由基和非自由基形式存在的高度活性的活性氧，普遍存在于细胞内。正常生理状态，ROS在细胞内的浓度受胞内内源性抗氧化基因的调控，保持动态平衡。当机体受外部环境影响，活性氧动态平衡被打破，就会使细胞中的DNA、蛋白质和细胞膜受到损伤，进而影响有丝分裂、突变及死亡[12]。因此，ROS水平也是细胞损伤程度的重要评价指标。MDA是脂质过氧化产物，常作为脂质过氧化的评价标准之一。SOD是细胞质和线粒体中的一种金属蛋白酶，也是细胞内重要的抗氧化剂，其含量和活性大小是抗氧化能力的直接反映。本研究利用1.5 mmol·L-1谷氨酸诱导PC12细胞24 h后，与M组比较，除ASⅠ组外，其余各给药组均细胞SOD活性显著提高，LDH、MDA和ROS的生成抑制。研究结果提示，AS在31.25～250 μmol·L-1浓度范围内，对谷氨酸所致PC12细胞损伤具有显著保护作用，其保护机制可能与抗氧化有关，但具体作用机制仍需进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.005

Protective Effects of Acteoside on PC12 Cell Injury Induced by Glutamate

PENG Xiaoming1，HUO Shixia1，GAO Li1，HE Yan2， YAN Ming1

(1.PrescriptionLaboratoryofXinjiangTraditionalUyghurMedicine，InstituteofXinjiangTraditionalUyghurMedicine，Urumqi830049，China;2.PharmaceuticalCollegeofShiheziUniversity，Shihezi832003，China)

Objective To investigate the effect of acteoside on injury PC12 cells induced by glutamate. Methods PC12 cells were assigned into normal control group, model control group, positive drug group and acteoside(AS) treated group.Every group was treated by 1.5 mmol·L-1glutamate for 24 hours except for the control group, and the injury was antagonized by 10 μmol·L-1Vit E and acteoside at different concentration(15.625, 31.25, 62.5, 125 and 250 μmol·L-1).Cell morphology was observed by inverted microscope, cell survival was determined with MTT, LDH activity was measured by enzyme label kit, the MDA content and SOD activity were measured by TBA kit and WST kit, and the ROS was measured by Elisa kit. Results Compared with the model control group, all doses of acteoside could significantly improve the PC12 cell morphology and survival(P<0.05), inhibit LDH activity and production of MDA and ROS (P<0.05), increase the activity of SOD (P<0.05), except for the lowest dose group. Conclusion Acteoside has protective effects on PC12 cells injured by glutamate.

Acteoside; Glutamate; PC12 cell; Injury; Protective effect

2014-03-20

2014-04-15

*新疆维吾尔自治区科研机构创新发展基金项目(2012015)；新疆维吾尔自治区公益性科研院所基金项目(KY2013103)

彭晓明(1983-)，男，湖南祁东人，助理研究员，硕士，研究方向：细胞与分子药理学。电话：0991-2565663，E-mail： pxm1983@163.com。

闫明 (1959-)，男，山西原平人，研究员，硕士，研究方向：药物分析与新药研发。电话：0991-2565663，E-mail：yanming21cn@sohu.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)03-0302-04