罗格列酮对肾小管上皮细胞间质转化的影响

王银，黄小妹，陈文莉

(武汉市中心医院肾内科，武汉 430014)

罗格列酮对肾小管上皮细胞间质转化的影响

王银，黄小妹，陈文莉

(武汉市中心医院肾内科，武汉 430014)

目的 探讨罗格列酮对转化生长因子-β(TGF-β)诱导的肾小管上皮细胞间质转化(EMT)过程的影响。方法 体外培养人肾小管上皮细胞HK-2，并给予不同浓度TGF-β及罗格列酮处理，观察HK-2形态学变化，利用免疫印迹检测过氧化物酶体增殖激活物受体γ(PPARγ)、SMAD家族成员2/3、钙粘附蛋白-E(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)水平变化，通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)术检测PPARγ、E-cadherin、Vimentin、锌指转录因子Snail及Slug的mRNA水平变化，并利用双荧光素酶报告基因检测TGF-β及罗格列酮对E-cadherin启动子活性的影响。结果 TGF-β可诱导HK-2细胞发生伪足增多变长、细胞间隙变大等EMT样形态学变化，进而激活TGF-β下游的SMAD2/3信号通路，导致上皮细胞标志E-cadherin表达明显减少，伴有间质细胞标志的Vimentin表达增高，转录因子Snail及Slug的mRNA水平分别升高6倍以上，伴随E-cadherin启动子活性下降70%。罗格列酮可以显著抑制上述TGF-β诱导的EMT过程，表现为HK-2细胞足减少变短，细胞间隙变小等，同时伴有E-cadherin表达增加，Vimentin表达降低，Snail及Slug的mRNA水平明显降低，E-cadherin启动子活性恢复到对照组水平。结论 罗格列酮可通过激活PPARγ促进E-cadherin转录活性及蛋白表达，拮抗TGF-β诱导的EMT过程。

罗格列酮；转化生长因子-β；上皮细胞间质转化；肾纤维化

上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一种细胞失去其上皮表型而获得间质细胞表型的过程，在胚胎发育、肿瘤发生发展中发挥重要作用[1]。研究表明，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)作为诱导肾上皮细胞发生EMT的重要细胞因子，与肾纤维化关系十分密切[2]。罗格列酮是过氧化物酶体增殖激活物受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)特异性外源性配体，通过激活PPARγ进而抑制TGF-β信号通路，从而延缓以肾脏纤维化为代表的一系列肾慢性疾病进程，对肾功能起保护作用[3]。但罗格列酮抑制TGF-β信号通路从而保护肾功能的机制尚不清。笔者利用体外培养的人肾小管上皮细胞HK-2作为实验模型，给予一定剂量罗格列酮及TGF-β刺激，观察罗格列酮是否可以逆转TGF-β诱导的肾小管上皮细胞EMT进程，以期为临床治疗肾脏纤维化提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人肾小管上皮细胞HK-2由武汉市中心医院实验室传代培养，以含10%小牛血清和100 U·mL-1青霉素及100 μg·mL-1链霉素的达尔伯克必需基本培养液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)置于37℃、5%二氧化碳培养箱常规培养。

1.2 主要试剂 罗格列酮片(葛兰素史克有限公司，批准文号：国药准字H20020475，规格：4 mg，批号：122320-73-4，将4 mg罗格列酮溶于2 mL DMSO，加无水乙醇至5 mL，辅料可基本溶解完全，-20 ℃储存待用)，TGF-β(Peprotech，批号：100-21)，抗PPARγ抗体(Santa Cruz，批号：sc-7196)，抗SMAD2/3抗体(Cell Signaling Technology，CST， 批号：5678)，抗p-SMAD2/3抗体(CST，批号：8828)，抗E-cadherin抗体(CST， 批号：3195)，抗Vimentin抗体(CST， 批号：5741)及抗内参GAPDH抗体(CST，批号：No.5174)等均购自武汉启动子生物有限公司。

1.3 PCR引物 自行设计，由武汉擎科生物公司合成。PPARγ (Forward Primer GGGATCAGCTCCGTGGATCT， Reverse Primer TGCACTTTGGTACTCTTGAAGTT)，E-cadherin(Forward Primer CGAGAGCTACACGTTCACGG， Reverse Primer GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG)， Vimentin (Forward Primer GACGCCATCAACACCGAGTT， Reverse Primer CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT)，Snail(Forward Primer TCGGAAGCCTAACTACAGCGA， Reverse Primer AGATGAGCATTGGCAGCGAG)，Slug(Forward Primer CGAACTGGACACACATACAGTG， Reverse Primer CTGAGGATCTCTGGTTGTGGT)，GAPDH(Forward Primer GAGAGACCCTCACTGCTG， Reverse Primer GATGGTACATGACAAGGTGC)。

1.4 实验分组 以终浓度为5 ng·mL-1TGF-β处理HK-2细胞48 h作为EMT诱导组，在此基础上给予1.25 μmol·L-1罗格列酮作为治疗组，以等量0.9%氯化钠溶液处理的HK-2细胞作为阴性对照组。检测指标：细胞形态学，TGF-β信号通路相关蛋白变化，EMT相关基因mRNA水平变化，E-cadherin启动子活性变化。

1.5 细胞形态学观察 将HK-2细胞按照上述方法处理。分别处理细胞48 h后，普通光学显微镜下观察HK-2细胞形态学变化，重点观察细胞轮廓形态、伪足长度及细胞间隙等。

1.6 免疫印迹(Western blot)检测TGF-β及罗格列酮处理后PPARγ、SMAD2/3、磷酸化SMAD2/3(p-SMAD2/3)、E-cadherin及Vimentin蛋白水平的变化 用0.25%胰酶消化收集细胞，加入适量NP-40细胞裂解液冰上裂解离心后取上清液，加入适量SDS上样缓冲液，混匀后100 ℃水浴5 min。继而蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)转膜并用脱脂奶粉封闭非特异性结合，然后依次孵育一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗，最后用ECL显色液显影。

1.7 实时荧光定量PCR(Realtime-q PCR)检测 TGF-β及罗格列酮处理后PPARγ、E-cadherin、Vimentin、锌指转录因子Snail及Slug的mRNA水平变化 收集细胞加入适量Trizol(Invitrogen)，三氯甲烷静置分层，取水相抽提总RNA，按反转录试剂盒(Fermentas，No.K1633，购自武汉博士德生物工程有限公司)操作说明合成cDNA，之后按实时荧光定量PCR试剂盒(Fermentas)应用上述引物行PCR扩增，ABI7300检测并分析。

1.8 双荧光素酶报告基因检测TGF-β及罗格列酮处理后E-cadherin启动子活性的变化 将HK-2细胞以每孔1×105个接种于24孔板，第2天当细胞约70%融合时，利用Lipofectamine 2000转染包含有E-cadherin启动子的荧光素酶质粒，加入不同浓度TGF-β及罗格列酮[药物终浓度：TGF-β 0～10 ng·mL-1；罗格列酮0～1.25 μmol·L-1。两药物按照梯度加入]。置37 ℃、5%二氧化碳培养箱培养48 h，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)在多功能光度计上测定并分析。

2 结果

2.1 罗格列酮对HK-2细胞形态学的影响 普通光学显微镜观察发现，HK-2细胞经过TGF-β(5 ng·mL-1)处理后，与阴性对照组比较，发生明显的EMT变化，细胞呈长梭形，伪足增多变长，细胞间隙变宽。而在给予TGF-β同时给予罗格列酮(1.25 μmol·L-1)，HK-2细胞形态恢复上皮细胞形状，细胞呈椭圆形，伪足减少变短，细胞间隙变窄。

2.2 罗格列酮对EMT相关蛋白表达的影响 将上述细胞裂解，提取总蛋白后行Western blot检测。结果显示，TGF-β可以激活SMAD信号通路，p-SMAD2及p-SMAD3含量明显增加，上皮性标志E-cadherin蛋白表达明显减少，间质性标志Vimentin表达明显增加；同时给予罗格列酮和TGF-β时，可激活PPARγ表达，抑制TGF-β所致p-SMAD2及p-SMAD3增加，E-cadherin表达较单加TGF-β处理明显增加，Vimentin表达较单加TGF-β处理明显减少(图1)。

2.3 罗格列酮对EMT相关基因mRNA水平的影响 上述分组处理细胞后， Realtime-PCR法检测PPARγ、E-cadherin、Vimentin、Snail及Slug的mRNA水平变化。结果提示，TGF-β可显著降低E-cadherin的mRNA水平，升高Vimentin、Snail及Slug的mRNA水平，而罗格列酮可通过上调PPARγ逆转TGF-β对E-cadherin的抑制作用，降低Vimentin、Snail及Slug等基因的mRNA水平(图2)。

图1 3组HK-2细胞EMT相关蛋白表达情况

Fig.1 Results of granuloma test in eight groups of mice

图2 罗格列酮可逆转TGF-β诱导的HK-2细胞EMT相关基因mRNA水平

Fig.2 Reversion of rosiglitazone on the mRNA express of EMT related gene induced by TGF-β in HK-2 cells

2.4 罗格列酮对E-cadherin启动子活性的影响 不同浓度TGF-β及罗格列酮处理HK-2细胞48 h后，检测荧光素酶活性。随着TGF-β浓度升高，TGF-β对E-cadherin启动子活性的抑制作用显著增加(P<0.05)，加入不同浓度罗格列酮可明显逆转这种抑制作用(P<0.05)(图3)。

3 讨论

EMT作为一种复杂而且重要的生物学效应，广泛参与多种病理生理进程，如胚胎发育，器官形成，慢性纤维化性疾病的发生发展及恶性肿瘤的侵袭转移[1，4]。由于慢性纤维化疾病发病隐匿，缺乏特效药物，给患者健康带来严重威胁，所以明确慢性纤维化疾病的病因，早期干预EMT进程有可能延缓慢性纤维化疾病的发生发展，故针对EMT开发特异性药物成为慢性纤维化疾病研究的当务之急。

TGF-β是一种作用广泛的细胞外因子，可以通过经典的SMAD信号通路及其他非经典途径介导细胞增殖、凋亡及形态学变化等一系列生物学行为的调控[5]。研究表明，TGF-β可通过EMT促进肺纤维化的发生发展[6]，因此调控TGF-β从而影响EMT可能是干预慢性纤维化进程的有效手段。

图3 罗格列酮可逆转TGF-β对E-cadherin启动子的影响

Fig.3 Reversion of rosiglitazone on the effect of TGF-β on E-cadherin promoter activity

噻唑烷二酮类药物(troglitazone，TZDs)是一类体外合成的可以增加胰岛素敏感性的化合物，其可以特异的高效结合并激活PPARγ，PPARγ继而结合于靶基因启动子区域的PPARγ结合元件，从而参与众多基因的转录调控[7]。TZDs目前临床上主要用于缓解2型糖尿病患者的胰岛素抵抗及治疗代谢综合征。既往研究发现，在大鼠5/6肾切除肾衰竭及大鼠单侧输尿管梗阻等模型中，罗格列酮可以减轻大鼠肾间质纤维化程度，对大鼠肾功能有一定保护作用[8-10]，但罗格列酮通过下调TGF-β保护肾脏功能的具体机制尚不清楚，本实验中笔者通过体外培养肾间质上皮细胞HK-2，发现罗格列酮在细胞形态学、蛋白水平及转录水平均可明显逆转TGF-β诱导的HK-2的EMT进程，而且笔者发现与EMT密切相关的锌指转录因子Snail及Slug均受到罗格列酮的调控，为进一步探索罗格列酮调控EMT的具体机制指出了方向，也是笔者继续研究的内容。

综上所述，罗格列酮作为PPARγ激动型配体，临床治疗中可以增加2型糖尿病患者对胰岛素的敏感性，并且对糖尿病肾病有一定治疗作用。研究表明，罗格列酮对肾脏的保护可能与其对TGF-β信号通路的抑制有关，但罗格列酮下调TGF-β缓解肾纤维化的具体机制尚不清楚，笔者通过体外实验发现罗格列酮可以逆转TGF-β诱导的肾小管上皮细胞EMT，为罗格列酮应用于临床肾纤维化治疗提供了实验基础。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.007

Effect of Rosiglitazone on the Epithelial-mesenchymal Transition Process of Renal Tubu-lar Epithelial Cell

WANG Yin，HUANG Xiaomei，CHEN Wenli

(DepartmentofNephrology，WuhanCentralHospital，Wuhan430014，China)

Objective To investigate the effect of rosiglitazone on the epithelial-mesenchymal transition process of renal tubular epithelial cell induced by transforming growth factor-β(TGF-β). Methods The human renal tubular epithelial cell line HK-2 was culturedinvitroand treated with TGF-β at the presence or absence of rosiglitazone， and the morphological changes of HK-2 cells were observed.Then PPARγ,SMAD family number 2/3,E-cadherin and Vimentin were detected by western blot， and the mRNA expression of PPARγ， E-cadherin， Vimentin， zinc finger transcription factor Snail and Slug were measured by realtime quantitative PCR.Finally，dual luciferase reporter assay was performed to detect the effect of TGF-β and rosiglitazone on the transcription activity of E-cadherin promoter. Results TGF-β could induce the EMT process of HK-2, including morphological changes such as longer pseudopod and broader cell space.TGF-β also activated the SMAD2/3 signaling pathway, with expression changes of E-cadherin and Vimentin.Rosiglitazone reversed the morphological changes of HK-2 cells induced by TGF-β, with shorter pseudopod and narrower cell space.Rosiglitazone also inhibited the mRNA and protein expressions of Vimentin, and restored the mRNA and protein expression of E-cadherin by up-regulating PPARγ.The activity of E-cadherin promoter was enhanced under the treatment of rosiglitazone. Conclusion Rosiglitazone can antagonize the EMT process of renal tubular epithelial cell induced by TGF-β, through the activation of PPARγ and stimulating transcription and protein expression of E-cadherin.

Rosiglitazone; Transforming growth factor-β; Epithelial-mesenchymal transition; Renal fibrosis

2014-05-24

2014-06-15

王银(1981-)，男，湖北武汉人，住院医师，硕士，主要研究方向：血管通路及急慢性肾衰竭。

黄小妹(1971-)，女，安徽合肥人，副主任医师，硕士，主要研究方向：血管通路及慢性纤维化性疾病。E-mail：878106214@qq.com。

R977.15；R965

A

1004-0781(2015)03-0310-04