穿山龙总皂苷对大鼠滑膜细胞株VEGF与AP-1的影响*

高亚贤，王永为，郭亚春，宋鸿儒，肖丽君，安高，梁秀军，翟泽玲，段一娜

(承德医学院1.免疫学教研室；2.人体解剖学教研室；3.病原生物学教研室；4.预防医学教研室，承德 067000)

·药物研究·

穿山龙总皂苷对大鼠滑膜细胞株VEGF与AP-1的影响*

高亚贤1，王永为2，郭亚春3，宋鸿儒1，肖丽君1，安高1，梁秀军1，翟泽玲1，段一娜4

(承德医学院1.免疫学教研室；2.人体解剖学教研室；3.病原生物学教研室；4.预防医学教研室，承德 067000)

目的 观察含穿山龙总皂苷血清对大鼠滑膜细胞株RSC-364血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA和激活蛋白-1(AP-1)活性的影响，探讨其抑制血管新生的作用机制。方法 制备含穿山龙总皂苷和雷公藤(阳性对照)血清。将培养好的大鼠滑膜细胞株RSC-364分为空白对照组、模型对照组、含雷公藤多苷血清组和含穿山龙总皂苷血清组，培养1 h，除空白对照组外，其余各组加入IL-17和TNF-α(均为10 μg·L-1)共同孵育24 h。采用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞VEGF mRNA表达，凝胶电泳迁移率实验法(EMSA)检测各组细胞核蛋白提取物AP-1 的DNA结合活性。结果 与空白对照组比较，模型对照组VEGF mRNA表达水平及AP-1 DNA结合活性显著增高(P<0.05，P<0.01)；与模型对照组比较，含雷公藤多苷血清组、含穿山龙总皂苷血清组VEGF mRNA表达水平及AP-1 DNA结合活性均降低(P<0.05)，且两组间比较，差异无统计学意义。结论 含穿山龙总皂苷血清可以抑制VEGF mRNA表达水平及AP-1 DNA结合活性，其机制可能是通过抑制转录因子AP-1来调控血管新生关键因子VEGF产生，进而抑制血管新生。

穿山龙总皂苷；关节炎，类风湿；血管新生；RSC-364；血管内皮生长因子；激活蛋白-1

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因尚未明了的慢性自身免疫性功能障碍性疾病。近年来研究发现，血管新生和血管翳的形成，在RA的发生发展过程中起至关重要的作用。血管新生是产生和维持RA血管翳的必需条件，因此，抑制血管新生可能是治疗RA的一个新靶点。笔者前期研究已经证实，穿山龙总皂苷抑制血管新生与抑制滑膜血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)表达有关[1]。另有研究发现，通过抑制激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)可以影响VEGF的表达[2]。在前期研究基础上，笔者以白细胞介素17 (interleukin-17,IL-17)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)联合诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364细胞模型为研究对象，通过观察穿山龙总皂苷对VEGF mRNA及AP-1活性的影响，从基因水平及其信号转导途径进一步了解穿山龙总皂苷抑制血管新生的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级Wistar大鼠30只，雄性，体质量(260±20) g，购自北京维通利华实验技术有限公司，动物合格证号：0248274，动物许可证号：SCXK(京)2009-0004。实验前适应性喂养1周，摄食标准颗粒饲料，自由饮水。动物房自然光线，温度、相对湿度分别维持在约20 ℃、70%。

1.2 细胞 大鼠滑膜细胞株RSC-364由河北医科大学惠赠。

1.3 药物与试剂 穿山龙总皂苷[承德医学院中药研究所提取，含量：6.5%。通过大量预实验，选择对实验结果影响较大的因素：乙醇浓度、加热温度、不同提取时间，以提取物中薯蓣皂苷元含量和转移率为指标，采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定薯蓣皂苷元含量；采用正交实验优选穿山龙总皂苷最佳提取工艺，优选后的穿山龙总皂苷最佳提取工艺为穿山龙饮片分别加入10倍和8倍量50%乙醇，85 ℃加热回流1 h，过滤，收集滤液，合并两次滤液，回收乙醇，喷雾干燥]；雷公藤多苷片(黄石飞云制药有限公司，规格：每片10 mg，批号：Z42021212)；Trizol Reagent 购自Invitrogen公司，批号：15596-026；RT master Mix以及Taq DNA polymerase购自大连宝生物公司，批号分别为DRR036s，DRR039s；Nuclear Extract Kit购自美国Active Motif公司，批号：40010；二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白含量测定试剂盒，购自美国Pierce公司，批号：23227；DIG Gel Shift Kit地高辛凝胶电泳迁移率实验(EMSA)试剂盒购自德国Roche公司，批号：03353591510；AP-1探针由上海基峰生物科技有限公司设计。

1.4 仪器 SLAN荧光定量PCR检测系统(Real-time PCR Detection System)：上海宏石医疗科技有限公司。

1.5 含药血清的制备与大鼠分组和给药方法 将穿山龙总皂苷和雷公藤多苷片分别溶于纯化水中，制成悬浊液。取Wistar大鼠30只，采用随机分组方法，根据随机分组表分组选取15只大鼠给予穿山龙总皂苷100 mg·kg-1·d-1，灌胃，另外15只大鼠给予雷公藤多苷片120 mg·kg-1·d-1，灌胃。均连续灌胃7 d，第8天给药1 h后，下腔静脉无菌取血，离心取血清，过滤除菌备用。

1.6 实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA表达水平

1.6.1 细胞分组及处理 选用处于对数生长期的RSC-364细胞，消化后制成2×104个·mL-1细胞悬液，接种于6孔板，每孔2 mL。将细胞分为空白对照组、模型对照组、含雷公藤皂苷血清组和含穿山龙总皂苷血清组，每组设复孔6个，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中培养，细胞长满6孔板80%后，将孔内培养液吸出弃去，空白对照组和模型对照组分别加入培养液和20%正常大鼠血清，含雷公藤皂苷血清组和含穿山龙总皂苷血清组分别加入培养液及20%含雷公藤皂苷血清(在加入细胞的培养液总体积中，大鼠含药血清体积占20%，其他正常基本细胞培养液如胎牛血清等占80%)和20%含穿山龙总皂苷血清，均培养1 h，除空白对照组外，其余各组加入TNF-α(10 μg·L-1)+IL-17(10 μg·L-1)，共同孵育24 h。

1.6.2 总RNA提取及cDNA合成 取“1.6.1”项培养的细胞，弃去上清液，Trizol法提取细胞总RNA，检测RNA纯度和浓度，取纯度较好的样品(260 nm/280 nm比值均在2.0～2.2)进行逆转录反应，反应体系10 μL，反应条件为37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，cDNA置-20 ℃冰箱保存备用。

1.6.3 PCR扩增VEGF VEGF及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldelyde-3-phosphate dehydrogonse,GAPDH)的引物、探针由大连宝生物公司合成(序列见表1)。反应体系25 μL，反应条件：95 ℃预变性60 s 、95 ℃、10 s，60 ℃、30 s扩增循环40个，60 ℃读取荧光。每个样品设平行复孔3个取平均值。依据所得目的基因与内参基因Ct值(Ct值即每个反应孔内荧光信号达到设定阈值时所对应的循环数)，用内参进行标准化处理，按照2-ΔΔCt法[3]对基因表达进行相对定量分析，ΔΔCt=(待测组目的基因Ct均值-待测组内参照基因Ct均值)-(对照组目的基因Ct均值-对照组内参照基因Ct均值)。2-ΔΔCt代表目的基因在不同组织的相对表达量，进行实验数据分析。

1.7 凝胶电泳迁移率实验法(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测AP-1 DNA结合活性

1.7.1 细胞分组及处理 同“1.6.1”项。

1.7.2 滑膜细胞核蛋白的提取 参照Nuclear Extract Kit说明书的操作步骤，提取滑膜细胞核蛋白，采用BCA分析法测定样本核蛋白浓度，将核蛋白分装置于-80 ℃冰箱保存备用。

表1 VEGF与GAPDH引物与探针序列

1.7.3 EMSA检测滑膜细胞核蛋白提取物AP-1的DNA结合活性 将适量核蛋白抽提物与地高辛标记的AP-1寡核苷酸探针结合，AP-1探针序列如下，P1：5′-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3′；P2：5′-TTCCGGCTGAGTCATCAAGCG-3′。实验中设置阴性对照组，只加入探针药物作为参照。反应产物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转膜，加化学发光底物(chemiluminescence substrate,CSPD)，X线胶片曝光，然后显影、定影，凝胶分析系统进行灰度扫描，以灰度值对转录因子和标记探针结合活性进行半定量分析。

2 结果

2.1 各组滑膜细胞VEGF mRNA的表达 SLAN荧光定量PCR检测系统扩增仪完成PCR反应后，自动生成荧光强度曲线，见图1。模型对照组VEGF目的基因表达量(3.67±0.51)，明显高于空白对照组[(1.0±0.28)，P<0.05]。含雷公藤皂苷血清组、含穿山龙总皂苷血清组VEGF目的基因表达量分别为(1.54±0.24)，(1.23±0.43)，与模型对照组比较，均明显降低(P<0.05)，两组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组滑膜细胞核蛋白提取物AP-1的DNA结合活性 与空白对照组(112.5±8.2)比较，模型对照组滑膜细胞核蛋白提取物AP-1 DNA结合活性(221.0±12.7)显著增高 (P<0.01)；与模型对照组比较，含雷公藤血清组和含穿山龙总皂苷血清组AP-1 DNA结合活性[分别为(116.5±8.2)和(118.0±10.9)]降低(P<0.05)，两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

control：空白对照组；IL-17+TNF-α：模型对照组；TP：含雷公藤皂苷血清组；RDN：含穿山龙总皂苷血清组

图1 VEGF和GAPDH扩增曲线

control：blank control group；IL-17+TNF-α：model control group；TP：tripterygium medicated serum group；RDN：total saponins medicated serum group

Fig.1 Amplification curve of VEGF and GAPDH

3 讨论

RA是一种慢性自身免疫性疾病，其主要病理特征为关节滑膜增生、血管翳形成及对称性、破坏性关节病变，其发病机制尚不清楚。血管新生是产生和维持RA血管翳的必要条件，在促进RA发生发展过程中具有重要作用[4-5]。

RA滑膜组织表达许多促血管生成因子，它们在RA血管生成的过程中发挥了重要作用，其中对VEGF的研究较为深入。VEGF是一种特异作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，属于血小板源生长因子家族成员，是促血管生成的主要因素之一。VEGF及其受体调控着内皮细胞增殖、迁移、管腔形成等重要环节，在血管新生中起着非常关键的作用[6]。正常情况下，血管内皮细胞更新缓慢，VEGF低表达，在RA患者的活组织检查中发现，滑膜细胞中VEGF的释放显著升高[7]。临床研究表明，RA患者的外周血VEGF越高，其受累的关节数目越多，关节病变越严重，并认为外周血的VEGF值可以作为像血沉一样反映RA患者病情严重程度的一项评价指标[8]。雷公藤是目前治疗RA药物中疗效已被肯定的中药[9]，雷公藤多苷是其主要成分。近年来，一系列文献报道雷公藤能够下调胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠滑膜组织VEGF的表达，抑制血管新生[10]。以往的研究均采用常规RT-PCR的方法，定量不准确，变异性较大。本研究采用实时荧光定量PCR方法对各细胞组VEGF mRNA的表达进行定量分析，结果显示IL-17+TNF-α诱导的细胞模型对照组VEGF目的基因表达量升高，含穿山龙总皂苷血清组VEGF目的基因表达量显著降低，其效果与含雷公藤血清组比较差异无统计学意义，提示穿山龙总皂苷可能通过抑制VEGF的表达进而减少血管新生，与文献[10]报道一致。

1.阴性对照组；2.空白对照组；3.模型对照组；4.含雷公藤皂 与空白对照组比较，*1P<0.01;与模型对照组比较，*2P<

苷血清组；5.含穿山龙总皂苷血清组 0.05

图2 4组AP-1的DNA结合活性比较(EMSA)

1.negative control group；2.blank control group;3.model control Compared with blank control group，*1P<0.01; compared

group;4.tripterygium medicated serum group;5.total saponins from with model group，*2P<0.05

RhizmaDioscreneNipponicaemedicated serum group

Fig.2 Comparison of DNA-bonding activity of AP-1 among four groups (EMSA)

AP-1是一类由早期反应基因编码而成的对氧化还原敏感的核转录因子，是由癌基因Fos和Jun家族的相关转录因子组合成的二聚体，其中c-fos和c-jun形成的异源二聚体是AP-1的主要形式，AP-1能直接或间接地识别或结合在同一顺式作用元件8-12bp核心序列上，参与许多生长因子和细胞因子的基因转录调控，导致机体一系列生理病理变化[11]。ASAHARA等[12-13]研究发现，RA 和CIA小鼠滑膜组织中 AP-1 活性明显高于骨关节炎，并主要定位于滑膜衬里层成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLSs)中。BOYLE等[14]从 CIA 小鼠滑膜组织中也观察到 AP-1 活性增高早于关节炎症状的出现以及基质金属蛋白酶的表达。在VEGF的基因中含有Jun/Fos二聚体即转录因子AP-1结合位点，佛波酯可以诱导早期应答基因c-jun/c-fos的表达来促进此位点的形成，进而与VEGF的基因结合来增强VEGF表达。有研究显示，雷公藤内酯醇能抑制佛波酯诱导的内皮细胞中VEGF的合成和分泌，也可以抑制原癌基因c-jun/c-fos mRNA在内皮细胞中的表达，提示TP可能通过抑制AP-1的形成，来影响VEGF的表达[2]。另有研究也表明，雷公藤可能通过抑制AP-1蛋白复合体的结合，抑制VEGF的合成[15]。在本实验中应用凝胶电泳迁移率实验检测各组细胞核蛋白提取物中AP-1的DNA结合活性，结果发现IL-17和TNF-α联合刺激可使AP-1的DNA结合活性显著增强，加入含穿山龙总皂苷血清可使IL-17和TNF-α联合刺激RSC-364细胞的AP-1的DNA结合活性减弱，且与含雷公藤血清组比较差异无统计学意义，表明穿山龙总皂苷可能抑制AP-1的活性，同时，前面实验已进一步证实穿山龙总皂苷可以显著降低VEGF mRNA水平，推测如文献报道[15]，穿山龙总皂苷可能通过抑制AP-1来下调VEGF的表达，进而抑制血管新生。

综上所述，本研究应用IL-17和TNF-α联合诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364细胞模型，证实了穿山龙总皂苷含药血清可以抑制VEGF mRNA的表达水平及AP-1的DNA结合活性，考虑穿山龙总皂苷可能通过抑制转录因子AP-1来调控血管新生关键因子VEGF的产生，进一步抑制RA血管新生。然而，细胞内存在的信号转导通路形成精密的调控网络，不同途径之间存在多种交互的联系，这给信号转导的研究带来了困难，关于穿山龙总皂苷抑制VEGF调控机制如何，仍有待进一步深入研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.001

Effects of Total Saponins fromRhizomaDioscreaeNipponicaeon VEGF and AP-1 in Rat Synovial Cell Strain

GAO Yaxian1，WANG Yongwei2，GUO Yachun3，SONG Hongru1，XIAO Lijun1，AN Gao1，LIANG Xiujun1，ZHAI Zeling1，DUAN Yina4

(1.DepartmentofImmunology；2.DepartmentofHumanAnatomy；3.DepartmentofPathogenBiology；4.DepartmentofPhylaxiology,ChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China)

Objective To study the effects of medicated serum with total saponins fromRhizomaDioscreaeNipponicae(RDN) on VEGF mRNA expression and AP-1 activity in rat synovial cell strain RSC-364 induced by IL-17 and TNF-α.To investigate the mechanism about total saponin from RDN inhibition of angiogenesis. Methods Medicated serum of total saponins from RDN and tripterygium (positive control) were prepared.Rat synovial cells RSC-364 were divided into four groups: the blank control，IL-17+TNF-α model，tripterygium medicated serum，and total saponins medicated serum groups.After one hour of incubation，all groups except for the blank control were incubated with both IL-17(10 μg·L-1) and TNF-α(10 μg·L-1) for 24 hours.VEGF mRNA expression in RSC-364 was detected by PrimeScriptTMreal-time quantitative PCR (RT-PCR) detection kit，and the AP-1 DNA-binding activity was detected by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Results Compared with the control blank group，both of the VEGF mRNA expression and AP-1 activity in rat synovial cell strain RSC-364 induced by IL-17 and TNF-α increased remarkably (P<0.05，P<0.01).The VEGF mRNA expression and AP-1 activity in tripterygium medicated serum group and total saponins medicated serum group were remarkably lower than those of the model control group (P<0.05).There was no significant difference between the two medicated serum groups. Conclusion Serum medicated with total saponins from RDN can remarkably decrease VEGF mRNA expression and AP-1 activity，indicating that the total saponins from RDN could influence VEGF secretion by inhibiting the AP-1 signal transduction pathway，VEGF is the key factor of angiogenesis，thereby to restrain angiogenesis.

Total saponins fromRhizomaDioscreaeNipponicae(RDN)；Arthritis,rheumatoid；Angiogenesis；RSC-364；Vascular endothelial growth factors；activator protein-1

2014-01-18

2014-02-21

*国家自然科学基金资助项目(30873420)；河北省自然科学基金重点项目(C2007000916)；河北省高等学校科学技术研究项目(ZH200806)

高亚贤(1984-)，女，河北廊坊人，讲师，硕士，研究方向：中药免疫学。电话：0314-2517004，E-mail：yaxiangao@163.com。

宋鸿儒(1961-)，男，河北承德人，教授，硕士生导师，研究方向：中药免疫学。电话：0314-2291166，E-mail：songhongru@163.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)03-0285-05