小白菊内酯改善胰岛素抵抗的分子学机制*
2015-06-24常化静何羡霞海洋吴新荣
常化静,何羡霞,海洋,吴新荣
(1.南方医科大学研究生院,广州 510515;2.广州军区广州总医院药学部,广州 510010)
小白菊内酯改善胰岛素抵抗的分子学机制*
常化静1,2,何羡霞2,海洋2,吴新荣2
(1.南方医科大学研究生院,广州 510515;2.广州军区广州总医院药学部,广州 510010)
目的 探讨小白菊内酯(PTL)对胰岛素抵抗(IR) 的作用及其分子学机制。方法 用不同浓度的胰岛素对HepG2 细胞进行不同时间的诱导,通过葡萄糖氧化酶法测定HepG2 细胞葡萄糖含量,明确建立稳定的HepG2胰岛素抵抗模型的胰岛素诱导浓度及诱导时间。模型建立后,应用不同浓度PTL分别作用于IR细胞24 h,通过CCK8法评价细胞活性,葡萄糖氧化酶法测定IR模型HepG2细胞葡萄糖消耗量,明确PTL最佳作用浓度,Q-PCR法检测细胞核因子κB(NF-κB)及IκBα mRNA表达情况,免疫蛋白印迹技术检测蛋白IκBα表达情况。结果 HepG2 细胞产生IR的最佳作用时间是24 h,最佳胰岛素浓度为10 μg·mL-1。PTL的最佳作用浓度为 20 μmol·L-1,应用其干预IR的HepG2细胞后,与IR的HepG2细胞相比,NF-κB活性明显降低(P<0.05),IκBα降解被抑制(P<0.05)。结论 PTL可明显抑制IκBα降解,减少NF-κB解离, 改善高胰岛素诱导产生的IR。
小白菊内酯;胰岛素抵抗;HepG2细胞;核因子κB;核因子κB抑制蛋白
小白菊内酯(parthenolide,PTL)是从天然紫苑属菊科植物Tanacetumparthenium中提取的倍半萜烯内酯类化合物,具有抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[1]。近年来,有研究证实PTL具有改善胰岛素抵抗(insulin resistence,IR)的作用[2]。另有文献报道糖尿病患者体内核因子kappaB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的激活与IR密切相关[3],但PTL改善IR的效应机制笔者尚未见报道。笔者在本实验中建立高胰岛素刺激人肝癌HepG2细胞所致IR模型,并采用PTL干预,观察其效应与机制。
1 材料与方法
1.1 细胞 人肝癌HepG2细胞株(广州军区广州总医院医学实验科提供)。
1.2 试剂 PTL(成都瑞芬生物科技有限公司,批号:GR-133-130120,含量>98%),二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,广州威佳科技有限公司,批号:D5879)溶液配成100 mmol·L-1并保存于4 ℃。胎牛血清(Gibco,批号:96118006-2),高糖培养液(DMEM/high glucose,批号:NXM0771,Hyclone),0.25%胰酶(Gibco,批号:21995)细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8,武汉博士德生物工程有限公司,批号:C0038)葡萄糖检测试剂盒(Glucose Assay Kit,武汉博士德生物工程有限公司,批号:GCK08);总RNA提取试剂盒(TriPure kit,ROX,批号:11667165001)、逆转录试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthensis Kit,ROX,批号:04896866001),荧光定量PCR反应试剂盒(FastStart Universal SYBR Green Master,ROX,批号:14526100);蛋白测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司,批号:P0010),兔一抗β-actin(cst,批号:122625)、兔一抗IκBα(cst,批号:44D4)、HRP标记的羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司,批号:BA1054)。
1.3 仪器 酶标仪(Biocell,型号:MultisKanS/N:1510-06233),二氧化碳(CO2)培养箱(Thermo,型号:LRH-250A),净化工作台(AIRTECH,型号:BCM-1000A),离心机(KUBOTA,型号:5220),冷冻型微量离心机(Thermo,型号:FRESCO17S/N:40990590/75002420),普能PCR仪(Thermo,型号:MJminiS/N:012025)。
1.4 细胞的培养 将人肝癌HepG2细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液,在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养。细胞贴壁生长,0.25%胰蛋白酶消化传代,每隔2 d换液,取对数生长期细胞进行实验。
1.5 HepG2细胞IR模型的建立 将细胞按照每孔5 000个接种于96孔板上,分为正常对照组和模型对照组。待细胞贴壁80%后正常对照组加入正常培养液,模型对照组加入新配制的胰岛素浓度分别4,8,10,20 μg·mL-1的培养液,继续孵育12,24,36和48 h,用葡萄糖氧化酶法分别测定各组细胞上清液葡萄糖水平,计算各模型对照组与正常对照组差值,差值越大IR越明显。选择24 h时间点测定CCK8,判断各组细胞活性。通过葡萄糖消耗差值计算、CCK8测定细胞活性,确定胰岛素最佳作用浓度和胰岛素作用时间,通过葡萄糖消耗差值计算确定最佳胰岛素浓度和胰岛素作用时间,由此建立适宜的高浓度胰岛素诱发的 HepG2细胞IR模型[4-6]。
1.6 PTL在HepG2的IR模型最佳实验浓度的筛选 复制IR模型,区组随机化分组法分为8组,其中7组分别加入PTL浓度为5,7.5,10,15,20,50,75 μmol·L-1的完全培养液进行干预,另一组作为模型对照组,同时以正常HepG2细胞作为正常对照组。正常对照组和模型对照组加入完全培养液继续培养。每组设复孔3个。药物干预24 h后,测定各组细胞上清液糖含量,每孔加入CCK8试剂10 μL,轻轻震荡混匀,继续孵育2 h,酶标仪(波长450 nm)测定吸光度(A值),判断细胞活性,确定PTL最佳实验浓度。细胞存活率(%)=(用药组A值/正常对照组A值)×100%。
1.7 Q-PCR法检测各组细胞NF-κB mRNA及IκBα mRNA表达 收集各组细胞,Trizol试剂提取总RNA,鉴定RNA完整性及纯度,各实验组按照逆转录试剂盒合成第一链cDNA,cDNA产物于-20 ℃冰箱保存。采用Rotor-Gene Q Series Software 1.7软件进行实时定量PCR扩增及荧光检测,PCR反应条件为95 ℃、10 s,55 ℃、30 s,70 ℃、30 s,共40个循环扩增目的基因,以β-actin作为内参引物序列:β-actin:5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′(forward),5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′(reverse);NF-κB:5′-GGACCAGCAAAGGTTATTGTTC-3′(forward),5′-TTATACACGCCTCTGTCATTCG-3′(reverse)[7-8];5′-ATGAATGGTGCGACAGCG-3′(forward),IκB:5′-CGTAGCCGAAGACGAGGG-3′(reverse)[9]。
1.8 Western blot 检测IκBα蛋白的表达 收集各组细胞,提取蛋白,蛋白试剂盒测定蛋白浓度,每孔上样蛋白45 μg,8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane,PVDF),室温封闭1.5 h,分别用一抗孵育4 ℃过夜,1×TBST缓冲液洗膜3次,每次10 min,再与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1:5 000)二抗孵育1 h,1×TBST缓冲液洗膜3次,每次10 min,显影,定影。Image J分析软件计算蛋白条带灰度值。
2 结果
2.1 不同胰岛素浓度和胰岛素作用时间对 HepG2 细胞IR的影响 见表1。随着时间和胰岛素浓度的增加,HepG2 细胞对葡萄糖的消耗量逐渐降低。胰岛素浓度为4 ,8 μg·mL-1时,孵育细胞12,24,36,48 h后,与正常对照组(胰岛素浓度为0)比较,模型对照组细胞上清液葡萄糖含量差异无统计学意义,IR不明显。与正常对照组比较,孵育细胞12 h后,10 μg·mL-1胰岛素组HepG2细胞开始出现IR(P<0.05),24 h后差异有统计学意义(P<0.01),IR明显。与正常对照组比较,20 μg·mL-1浓度组在各个时间点,HepG2 细胞上清葡萄糖含量差异有统计学意义(P<0.01),IR明显。不同浓度胰岛素作用24 h后,CCK-8法吸光度值检测,正常对照组吸光度值为(0.76±0.03),10 μg·mL-1胰岛素组吸光度值为(0.53±0.04),与正常对照组比较差异无统计学意义。20 μg·mL-1胰岛素组吸光度值为(0.35±0.05),与正常对照组比较差异有统计学意义。表明高浓度胰岛素诱发的HepG2细胞IR模型造模最佳胰岛素浓度为10 μg·mL-1,最佳作用时间24 h。
表1 不同浓度胰岛素不同作用时间的细胞上清液葡萄糖水平
与0 μg·mL-1胰岛素比较,*1P<0.05,*2P<0.01
Compared with normal control group(without insulin),*1P<0.05,*2P<0.01
2.2 PTL在HepG2的IR模型最佳实验浓度的筛选 见表2。不同浓度PTL干预后,与模型对照组比较,各浓度组葡萄糖消耗能力有一定程度提高(P<0.05),IR状态有所改善,且随着PTL浓度增加,葡萄糖消耗量明显增加,推测药物有量效关系。药物干预后,与模型对照组比较,50,75 μmol·L-1胰岛素组细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05),PTL最佳试验浓度为20 μmol·L-1。
2.3 Q-PCR法检测各组细胞NF-κB mRNA及IκBα mRNA的表达 10 μg·mL-1胰岛素作用于HepG2细胞24 h后 根据 2-ΔΔCt计算各基因相对表达量,正常对照组2-ΔΔCt值为1,模型对照组细胞NF-κB mRNA相对表达量(1.91±0.256),IκBα mRNA相对表达量(0.78±0.180),与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),表明HepG2细胞产生IR后NF-κB mRNA表达明显上调,IκBα mRNA明显下调;采用20 μmol·L-1PTL干预24 h后,NF-κB mRNA相对表达量(1.22±0.195)(P<0.05),IκBα mRNA相对表达量(0.96±0.134)(P<0.05),与模型对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。表明PTL干预后,HepG2细胞中NF-κB mRNA表达明显下调,IκBα mRNA表达上调。
表2 不同浓度PTL对IR模型对照组细胞上清液葡萄糖水平及细胞存活率的影响
与正常对照组比较,*1P<0.05
Compared with normal control group(without insulin),*1P<0.05
2.4 Western blot 检测IκBα蛋白的表达 以目的蛋白IκBα蛋白的条带灰度均值作半定量比较,正常对照组灰度值为(0.632 2±0.231),模型对照组IκBα蛋白灰度值为(0.373 8±0.256),与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);20 μmol·L-1PTL干预后IκBα蛋白灰度值为(0.600 4±0.195),与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),表明PTL可明显抑制模型对照组IκBα蛋白降解。
3 讨论
IR是2型糖尿病发病的关键因素之一, 若得不到及时改善,向心性肥胖、高脂血症、冠心病、高血压等代谢综合征的危险性将大大增加[10]。早期干预和治疗以逆转IR,成为治疗2型糖尿病和代谢综合征(metabolic syndrom,MS)的重要模式之一。有研究发现,PTL是继阿司匹林后又一个具有抗炎作用的活性成分[11], 另外已有研究报道证实,PTL也有类似阿司匹林的逆转IR作用,但具体机制尚不清楚[12]。
本研究应用高浓度胰岛素诱导HepG2细胞制备IR模型,模拟体内IR发生过程。在IR建立过程中,以模型细胞的葡萄糖利用及细胞活力测定来判断模型成功标准,最终确定10 μg·mL-1胰岛素为最佳IR浓度, 24 h为最佳作用时间,成功建立HepG2细胞IR模型,从而为筛选治疗2型糖尿病的中药奠定了基础。
正常情况下,NF-κB以一种不活泼的状态存在,IκBα是调控NF-κB的关键蛋白,NF-κB未被激活时和IκBα形成复合物[13]。当炎症因子及其他诱导因素存在时,NF-κB被激活,IκBα被磷酸化,随后被泛素-蛋白酶体途径降解。NF-κB和IκBα解聚后,其核定位序列被暴露,从而被转运到细胞核内促进NF-κB依赖的基因转录[14]。因此,通过Western blot 检测IκBα是否显著降解是检测NF-κB是否激活的一个重要指标。研究证实,不管病程长短,糖尿病患者体内均有NF-κB异常表达[15]。高胰岛素诱导的HepG2细胞,IκBα蛋白降解,NF-κB信号通路被激活,20 μmol·L-1PTL干预后,已经发生IR的HepG2细胞IκBα蛋白降解,表明PTL可以阻断NF-κB信号通路表达。
本研究结果表明,PTL能抑制高胰岛素诱导的IR的HepG2细胞中IκBα蛋白降解,进而抑制NF-κB进入细胞核,进一步表明PTL可以通过阻断NF-κB信号通路来改善逆转HepG2细胞的IR状态,PTL在糖尿病的治疗过程中可能具有重要作用,对延缓糖尿病的发展可能具有重要的临床意义,但具体的作用靶点尚待进一步研究。
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DOI 10.3870/yydb.2015.03.003
Molecular Mechanism of Parthenolide Improving Insulin Resistance Induced by Insulin
CHANG Huajing1,2,HE Xianxia2,HAI Yang2,WU Xinrong2
(1.GraduateSchoolofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2.DepartmentofPharmacy,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommandofPLA,Guangzhou510010,China)
Objective To investigate the reversal effect and molecular mechanisms of NF-κB inhibitor parthenolide (PTL) on insulin resistance (IR). Methods HepG2 cells were treated with insulin at different concentrations and time points, the glucose consumption of HepG2 cells was measuredviaglucose oxidase method to determine the best concentrations and time for establishing insulin-induced insulin resistance on HepG2 cells.After modeling, different concentrations of PTL were added in cells for 24 h for determining cell activity and glucose-consumption.Q-PCR was used to detect the expression of NF-κB and IκBα mRNA in cells, and western blot was used to detect the expression of protein IκBα. Results The best reaction time and concentration for insulin inducing resistance of HepG2 cells were 24 h and at 10 μg·mL-1.The optimum acting dose of PTL was 20 μmol·L-1.NF-κB activity was significantly reduced (P<0.05), IκBα degradation was significantly inhibited (P<0.05) compared to HepG2 cells with insulin resistance upon intervention on insulin resistance HepG2 cells by PTL. Conclusion PTL can inhibit IκBα degradation and disassociation of it from NF-κB, which in turn improves insulin resistance, providing theoretical basis for preventing and treating diabetes with PTL.
Parthenolide; Insulin resistance; HepG2 cell; Nuclear factor kappaB; Inhibitor of nuclear factor kappaB
2014-03-22
2014-04-21
*广东省重大科技专项(2011A080300004)
常化静(1990-),女,山东菏泽人,在读硕士,主要研究方向:中药制剂开发。电话:020-88654670,E-mail:843118534@qq.com。
吴新荣(1959-) ,女,主任药师,博士生导师,硕士,研究方向:中药筛选及药理研究。电话:020-88653476,E-mail:gzwxrong@yahoo.com。
R286;R965
A
1004-0781(2015)03-0294-04