HPLC-DAD法同时测定“武当二号”忍冬叶中绿原酸和木犀草苷的含量*

李鹏，郑芳，李聪，李志浩，黄麟杰，朱雪松

(湖北医药学院附属东风医院药学部、武当特色中药研究湖北省重点实验室，十堰 442008)

HPLC-DAD法同时测定“武当二号”忍冬叶中绿原酸和木犀草苷的含量*

李鹏，郑芳，李聪，李志浩，黄麟杰，朱雪松

(湖北医药学院附属东风医院药学部、武当特色中药研究湖北省重点实验室，十堰 442008)

目的 建立同时测定“武当二号”忍冬叶中绿原酸和木犀草苷含量高效液相色谱测定方法。方法 采用Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相为乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)进行梯度洗脱；检测波长350 nm；流速0.8 mL·min-1；柱温32 ℃。结果 绿原酸、木犀草苷分别在进样量0.285～2.280，0.124～1.240 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数分别为0.999 3，0.999 4；平均加样回收率分别为98.9%，98.8%(n=6)，RSD分别为1.59%，1.84%。结论 该方法准确、快速、重复性好，可以用来同时测定“武当二号”忍冬叶中绿原酸和木犀草苷的含量。

“武当二号”忍冬叶；绿原酸；木犀草苷；检测器，高效液相色谱法-二极管阵列

“武当二号”忍冬为树形忍冬即木本忍冬，为湖北武当生物医药科技有限公司将山东“亚特良种忍冬(LonicerajaponicaYatehong LSB)”(经国家林业局审定)与武当地区忍冬相结合进行培育，培植出适合十堰地区生长的优良独特品种。该品种不同于普通的藤本忍冬品种(把传统藤本培育成小灌木)，生长快，一年可采四季，采收省工，且产量是传统品种的数倍，具有很高的经济价值和药用价值。金银花是我国常用中药材，具有疏散风热、清热解毒的功效[1]。忍冬的叶即忍冬叶与金银花均有清热解毒之功效[2]，每年随着忍冬植株整形修剪可以得到大量的枝叶，其产量是花的数倍，但作为金银花副产物，忍冬叶一直被视为非药用部位而未得到充分利用，造成了极大的资源浪费[3]。忍冬叶主要化学成分为绿原酸类、黄酮类、环烯醚萜类等，目前研究的重点是绿原酸类和黄酮类，也是发挥药效作用物质基础[4]。《中华人民共和国药典》2010年版一部已将绿原酸(有机酸类)和木犀草苷(黄酮苷类)作为金银花的质量控制指标，但“武当二号”忍冬叶中有关绿原酸、木犀草苷的含量测定方法笔者未见文献报道。本实验参考相关文献[5-12]，采用反相高效液相色谱法同时测定“武当二号”忍冬叶中绿原酸和木犀草苷的含量，操作简便、快速、重复性好，为建立“武当二号”金银花叶质量标准提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UltiMate 3000 高效液相色谱仪(DIONEX)，UltiMate3000 Photodioce Array Detector(DIONEX)，UltiMate 3000 Pump(DIONEX)，Chromeleon色谱工作站(DIONEX)；KQ-100DB型数控超声波清洗器(功率100 W，频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)；FW100型高速万能粉碎机[CZX-OH-40X4-5型，额定频率(50±1) Hz，天津市泰斯特仪器有限公司]；电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；AEU-210万分之一电子分析天平(日本岛津公司)。

1.2 试药 绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110753-200212)；木犀草苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111720-200604)；武当二号忍冬叶2013年5月采自湖北武当生物医药科技有限公司种植园，经湖北医药学院附属太和医院武当研究所陈吉炎教授鉴定为忍冬科植物红白忍冬[LonicerajaponicaThunb.var.chinensis(Wats.) Bak.] 的干燥叶；乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)；冰醋酸为科密欧色谱纯试剂(天津市科密欧化学试剂开发中心)；甲醇(分析纯，批号：20110913)、无水乙醇(分析纯，批号：20110515)，均购于武汉市中天化工有限责任公司；水为经检验合格的自制注射用水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性实验 色谱柱：Phenomenex ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：以乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)，进行梯度洗脱，洗脱程序为：0～6 min，A：B=13：87；～7 min，A13%→20%，B87%→80%；～17 min，A：B=20：80；～18 min，A20%→13%，B80%→87%；～25 min，A：B=13：87；检测波长350 nm；流速0.8 mL·min-1；柱温32 ℃；进样量10 μL。依照上述色谱条件，分别进样绿原酸、木犀草苷对照品溶液、“武当二号”忍冬叶样品溶液，记录色谱图(图1)。结果绿原酸、木犀草苷保留时间分别约为5.7，13.3 min，理论板数按绿原酸峰计不低于7 000，按木犀草苷峰计不低于40 000，且各色谱图中绿原酸和木犀草苷峰的DAD匹配值均不低于999.8，说明绿原酸和木犀草苷峰基本为纯峰[12]。

2.2 对照品溶液制备 称取绿原酸对照品57.0 mg，加50%甲醇溶解稀释，配制成0.57 mg·mL-1对照品储备液，取适量用50%甲醇稀释10倍，得57 μg·mL-1对照品溶液；精密称取木犀草苷对照品6.2 mg，加70%乙醇溶解稀释，配制成62 μg·mL-1对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取在40 ℃下，于电热恒温干燥箱中干燥的“武当二号”忍冬叶(过孔径0.25 mm 筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，精密称定，回流2 h，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，用孔径0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液适量为供试品溶液。

2.4 标准曲线的绘制 在“2.1”项色谱条件下，分别进样“2.2”项下的绿原酸对照品溶液0.285，0.570，0.855，1.140，1.710，2.280 μg和木犀草苷对照品溶液0.124，0.248，0.372，0.620，0.930，1.240 μg，记录各自峰面积。以各自进样量X(μg)为横坐标，相对应峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得绿原酸和木犀草苷的回归方程分别为：Y绿=52.16X绿+1.509(r=0.999 3，n=6)，Y木=52.916X木+0.149 1(r=0.999 4，n=6)，结果表明，绿原酸和木犀草苷进样量分别在0.285～2.280，0.124～1.240 μg范围内与其对应的峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验 精密吸取“2.2”项浓度为57 μg·mL-1绿原酸对照品溶液和浓度为62 μg·mL-1的木犀草苷对照品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下，分别重复进样6次，记录峰面积，结果绿原酸和木犀草苷峰面积的RSD分别为0.56%(n=6)，0.69%(n=6)。

2.6 重复性实验 取同一批号(批号：20130502)的“武当二号”忍冬叶，按“2.3”项方法平行操作，制备6份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样，记录峰面积并计算绿原酸和木犀草苷含量，结果RSD分别为1.58%(n=6)，1.87%(n=6)。结果表明本方法重复性良好。

A.混合对照品；B.绿原酸对照品； C.木犀草苷对照品；D.“武当二号”忍冬叶样品；1.绿原酸；2.木犀草苷

A.mixed reference；B.chlorogenic acid control；C.galuteolin control reference；D.“WudangNO.Ⅱ” honeysuckle leaves sample；1.chlorogenic acid；2.galuteolin

Fig.1 HPLC chromatogram of four kinds of solutions

2.7 稳定性实验 精密吸取批号为20130502 “武当二号”忍冬叶(含绿原酸和木犀草苷分别为1.86%，0.23%)的供试品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下，分别于0，4，8，12，16，24 h进样，记录峰面积，得绿原酸和木犀草苷峰面积的RSD分别为0.99%，0.91%，说表明在24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.8 加样回收率实验 精密称取“2.7”项已测含量的“武当二号”忍冬叶(批号：20130502)各18份，每份约0.5 g，均分二组。一组分别精密加入浓度为0.93 g·L-1绿原酸对照品溶液8.0，10.0，12.0 mL(各3份)，另一组分别精密加入浓度为0.58 g·L-1木犀草苷对照品溶液1.8，2.0，2.4 mL(各3份)，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，将上述供试品溶液各进样5 μL(每份进样3次)，计算平均含量和回收率。结果绿原酸和木犀草苷的平均回收率分别为98.9%，98.8%；RSD分别为1.59%，1.84%，见表1。

2.9 样品含量测定 按“2.3”项方法，测定3批“武当二号”忍冬叶中的绿原酸和木犀草苷的含量，并与同一批在同样干燥条件下(40 ℃中电热恒温干燥箱中干燥)的“武当二号”金银花在不同花期(花蕾期、银花期、金花期)中的绿原酸和木犀草苷的含量做了对比，结果见表2。

表1 绿原酸和木犀草苷加样回收率实验结果

Tab.1 Recovery results of chlorogenic acid and galuteolin

组分取样量/g原有量加入量测得量mg回收率/%绿原酸0.50069.3117.44016.63998.50.50139.3247.44016.890101.70.50439.3807.44016.64197.60.50369.3679.30018.55598.80.51059.4959.30018.53597.20.50429.3789.30018.64199.60.51029.49011.16020.41697.90.50209.33711.16020.27498.00.51119.50611.16020.789101.1木犀草苷0.51071.1751.0442.19998.10.50521.1621.0442.221101.40.52041.1971.0442.21597.50.51511.1851.1602.32498.20.51001.1731.1602.29897.00.50831.1691.1602.32899.90.51231.1781.3922.53997.80.50201.1551.3922.51197.40.51111.1761.3922.594101.9

3 讨论

《中华人民共和国药典》2010年版一部规定用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-pheny (250 mm×4.6 mm，5 μm)的色谱柱测定木犀草苷的含量，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱测定绿原酸的含量，本实验选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱同时测二成分的含量。曾实验过大连依利特 Hypersil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Shodex Rspak DE C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent HC C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，最后根据色谱峰的柱效、分离效果、DAD匹配值及重复性等因素综合考虑，选择使用Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱。

表2 样品中绿原酸和木犀草苷的含量测定结果

Tab.2 Content determination of chlorogenic acid and galuteolin in samples %，n=3

本实验确定流动相B组分时，比较0.2%，0.4%磷酸溶液和0.2%，0.5%冰醋酸溶液，结果选择0.4%磷酸溶液时，绿原酸峰和木犀草苷峰的理论板数最高，且均超过《中华人民共和国药典》2010年版一部规定(理论板数按绿原酸峰计不低于1 000、按木犀草苷峰计不低于20 000)的数倍；选择流动相时曾使用等度洗脱，由于“武当二号”忍冬叶的化学成分复杂，虽然其绿原酸达到基线分离，但木犀草苷峰受相邻峰的干扰很大，其峰的DAD匹配值很难达到999.0，故最终选用本文梯度洗脱程序。

本实验参考文献[12]，以50%甲醇为提取溶剂、液料比为100 mL·g-1条件下，分别比较了超声30，40，50，60，70，80，90 min(超声功率100 W，频率40 kHz)和回流60，80，100，120 min的提取率。结果超声提取时，超声80 min绿原酸和木犀草苷含量最高；回流提取时，回流120 min绿原酸和木犀草苷含量最高；但回流120 min绿原酸和木犀草苷含量比超声80 min均高，故本实验采用回流120 min提取“武当二号”忍冬叶中绿原酸和木犀草苷。

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.025

Simultaneous Determination of Chlorogenic Acid and Luteoloside in the Leaves of“WudangNo.Ⅱ”Flos Lonicerae by HPLC-DAD

LI Peng, ZHENG Fang, LI Cong, LI Zhihao, Huang Linjie, ZHU Xuesong

(DepartmentofPharmacy,AffiliatedDongfengHospital,HubeiMedicalUniversity,HubeiKeyLaboratoryofWudangLocalChineseMedicineResearch,Shiyan442008,China)

Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid and luteoloside in the leaves of “WudangNo.Ⅱ” flos lonicerae. Methods Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used; the mobile phase was acetonitrile(A)and 0.4% phosphoric acid aqueous solution(B)by gradient elution mode; the detection wavelength was 350 nm and the flow rate was 0.8 mL·min-1; the column temperature was set at 32 ℃. Results The calibration curve of chlorogenic acid and luteoloside to the peak area was linear in the range of 0.285-2.280 μg(r=0.999 3), and 0.124-1.240 μg(r=0.999 4), respectively.The mean recovery of chlorogenic acid and luteoloside was 98.9%, RSD=1.59% and 98.8%, RSD=1.84%, respectively. Conclusion This method is found to be accurate, quick and reproducible.It can be used for simultaneous determination of chlorogenic acid and luteoloside in the leaves of “WudangNO.Ⅱ”flos lonicerae.

Leaves of“WudangNo.Ⅱ” flos lonicerae；Chlorogenic acid；Luteoloside; Detector, high performance liquid chromatography-diode array

2013-12-16

2014-07-03

*湖北省2011协同创新中心基金(4)

李鹏(1968-)，男，湖北十堰人，副教授，主任药师，在读博士，主要从事医院药学工作。电话：0719-8272346，E-mail：dfyylp@163.com。

朱雪松(1974-)，男，湖北十堰人，副教授，主任药师，主要从事医院药学工作。电话：0719-8272346，E-mail：dfpharmacy@163.com。

R282.71；R927.2

B

1004-0781(2015)05-0660-04