竹柏果皮和果壳中挥发油成分及其抗肿瘤活性研究

廖泽勇，韦玮

(1.广西壮族自治区药用植物园，南宁 530023；2.广西壮族自治区骨伤医院，南宁 530012)

竹柏果皮和果壳中挥发油成分及其抗肿瘤活性研究

廖泽勇1，韦玮2

(1.广西壮族自治区药用植物园，南宁 530023；2.广西壮族自治区骨伤医院，南宁 530012)

目的 比较瑶药竹柏果皮和果壳中挥发油成分，并对两部位的挥发油进行抗肿瘤活性研究。方法 应用水蒸气蒸馏法分别从竹柏果皮和果壳中提取挥发油，并结合气相色谱-质谱法分析其化学成分；采用噻唑蓝(MTT)法分别对果皮和果壳挥发油进行抗肿瘤活性研究。结果 竹柏果皮挥发油收率为0.23%，分离出21种成分，鉴定18种，主要含有石竹烯，占挥发油总量的72.44%；竹柏果壳挥发油收率为0.15%，分离出15种成分，鉴定其中13种，与果皮共有4种成分；竹柏果皮和果壳挥发油对鼻咽癌细胞均具有抑制增殖活性，半数抑制浓度分别为54.58和114.83 μg·mL-1，果皮挥发油抑制活性较强。结论 从竹柏果皮和果壳中提取挥发油主要成分为烯类、醇类、萜类，其中果皮挥发油具有较强的抗肿瘤活性。

竹柏；挥发油；化学成分；抗肿瘤活性

竹柏[Podocarpusnagi(Thunb.)Zoll.et Mor.ex Zoll.Myrica nagi Thunb.]为罗汉松科植物竹柏的枝叶，又名铁甲树、罗汉柴、青柏木、竹叶图、山杉等，主要分布于我国广西、广东、福建及台湾等地。竹柏具有止血、接骨功效，主治外伤出血、骨折[1]。《浙江药物植物志》记载其治外伤出血、骨折，外用适量鲜品捣敷，或干品末调敷[2]。竹柏多为瑶族民间用药，具有净化空气、驱蚊虫、抗污染和治疗肿瘤的功效，还可以舒筋活血，治疗腰肌劳损、止血接骨；治外伤骨折、刀伤、枪伤、狐臭、眼疾、感冒等；鲜树皮或根适量，水煎熏洗患处，治风湿性关节炎。现代研究发现竹柏的枝、叶及种子均含有多种有效化学成分，包括二萜类、竹柏内酯类、黄酮、环肽类等，该类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抑制多种菌的活性[3-5]。此外，竹柏叶挥发油中含有榄香烯、荜澄茄烯、β-古芸香烯、蒎烯、石竹烯等[6]。为进一步研究开发竹柏的果皮与果壳，笔者对竹柏果皮与果壳的挥发性成分进行分析鉴定，并对其抗肿瘤活性进行了初步筛选。

1 材料与方法

1.1 材料 竹柏果于2012年采自广西壮族自治区药用植物园内，经广西壮族自治区药用植物园凌征柱教授鉴定为罗汉松科竹柏属植物竹柏[Podocarpusnagi(Thunb.)Zoll.et Mor.ex Zoll.Myrica nagi Thunb.]的果，阴干后将果皮和果壳剥离并粉碎，密封备用。鼻咽癌CNE细胞株购于中国科学院上海分院细胞库，胰蛋白酶、RPMI1640培养液购自Gibico公司，胎牛血清购自HyClone公司(批号：8172881)，二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(批号：116K012)、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(批号:120609)购自Sigma公司，细胞培养瓶、96孔细胞培养板购自康宁公司，无水硫酸钠、乙醚为分析纯，水为去离子水。

1.2 仪器 挥发油提取器(四川蜀牛公司)；N-1100V-W(WD)型旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)；300型气质联用仪(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)(Varian公司)；二氧化碳(CO2)培养箱(上海博讯实业有限公司)；倒置显微镜(德国徕卡公司)；F200型酶标仪(瑞士TECAN公司)。

1.3 挥发油提取 取粉碎后的竹柏果皮和果壳粉末100 g，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入5倍量去离子水浸泡12 h，电热套加热回流8 h，回流上层液用乙醚萃取3次，萃取液合并，除去乙醚，呈棕黄色油状液体，加入无水硫酸钠去除残留水分，计算挥发油提取率。

1.4 GC-MS分析 GC分析条件：采用VF-5ms型石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，起始温度60 ℃维持2 min，升温到140 ℃维持5 min(升温速率10 ℃·min-1)，再升温到200 ℃维持15 min(升温速率2 ℃·min-1)，最后升温到250 ℃(升温速率10 ℃·min-1)，维持温度到完成样品分析，载气为高纯氦(He)(99.9%)，柱流量为1.0 mL·min-1，气化室温度为250 ℃，进样量为1 μL，分流比20：1。

MS分析条件：质谱仪为Varian 300-MS，EI离子源，质荷比(m/z)扫描范围为45～500 AMU，扫描周期1 s，电子能量1.12×10-17J(70 eV)，传输线温度为250 ℃，离子源温度为200 ℃。

1.5 抗肿瘤活性测定 取胰蛋白酶消化后的对数生长期细胞，用细胞完全培养液稀释至5×104个·mL-1，接种于96孔细胞培养板上，每孔190 μL。在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，实验组按倍半稀释法设置5个不同浓度药液，同时设置阴性对照组、正常对照组，每组4个复孔。在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养48 h，每孔加入5 mg·mL-1MTT 10 μL，之后培养4 h形成甲穳沉淀，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，使甲臜结晶充分溶解，呈现深蓝色，选择492 nm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度(A值)，记录结果，按下式计算各药物对肿瘤细胞生长抑制率[7]。肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组A值/阴性对照组A值)×100%。

2 结果

2.1 竹柏果皮和果壳挥发油的化学成分比较 采用水蒸气蒸馏法从竹柏果皮和果壳中提取挥发油，得率分别为0.23%和0.15%，果皮挥发油得率较高。经GC-MS对2种竹柏部位挥发油成分进行分析，得到其总离子流图，竹柏果皮、果壳分别检测出21，15种成分。经计算机NIST05数据库检索离子峰组分，并采用面积归一化法计算其含量，确定竹柏果皮挥发油18种成分、竹柏果壳13种成分，其中果皮主要成分为β-石竹烯(41.25%)、α-石竹烯(31.19%)，果壳中主要成分为n-十六碳酸(36.51%)、2-氯乙基亚油酸(33.25%)、顺-11-十六碳烯酸(22.85%)，两者共有成分仅4种，存在较大差异。结果见图1，2和表1。

1.β-石竹烯；2.α-石竹烯

Fig.1 GC-MS chromatogram of volatile oil fromPodocarpusnagipeel

1.n-十六碳酸；2.2-氯乙基亚油酸

Fig.2 GC-MS chromatogram of volatile oil fromPodocarpusnagishell

2.2 竹柏果皮和果壳挥发油抗肿瘤活性 20，40，80，100，120 μg·mL-1竹柏果皮挥发油对鼻咽癌CNE细胞的抑制率分别为(22.62±0.54)%，(43.02±1.27)%，(52.55±2.83)%，(73.24±1.79)%，(84.18±3.37)%；20，40，80，100，120 μg·mL-1竹柏果壳挥发油对鼻咽癌CNE细胞的抑制率分别为(18.37±1.13)%，(23.74±0.52)%，(38.55±1.04)%，(42.96±2.15)%，(68.14±2.06)%。不同浓度的竹柏果皮和果壳挥发油对鼻咽癌肿瘤细胞鼻咽癌CNE的增殖有不同程度的抑制作用，并呈剂量依赖关系，半数抑制浓度分别为54.58和114.83 μg·mL-1。当果皮和果壳挥发油作用浓度为200 μg·mL-1时对鼻咽癌CNE细胞增殖的抑制作用最强。果皮挥发油抗肿瘤活性优于果壳挥发油。

表1 竹柏果皮和果壳的挥发油成分比较

…：未测出

…：not detected

3 讨论

竹柏为罗汉松科裸子植物，起源于白垩纪，常被称为植物界活化石，多为雌雄异株，生殖器官较为特殊。为获取更多化学特征及更多药理活性物质，本研究采用水蒸气蒸馏法提取竹柏果皮和果壳中的挥发油，抗肿瘤活性较强的果皮挥发油中主要成分为石竹烯，具有潜在的医药应用价值。石竹烯是一种双环倍半萜型的天然产物，其结构独特，具有局部麻醉、抗炎、驱除蚊虫、抗焦虑和抑郁、镇咳和祛痰、镇痛、细胞毒性等作用[8]。MONZOTE等[9]研究表明，石竹烯氧化物能抑制线粒体电子传递体复合物Ⅰ，从而抑制呼吸链，具有细胞毒性。石竹烯细胞毒作用可能通过抑制呼吸链而达到抑制肿瘤细胞的增殖。果壳挥发油与果皮成分差异较大，主要成分包括n-十六碳酸、2-氯乙基亚油酸、顺-11-十六碳烯酸，均为接近果仁成分的脂肪酸类物质，其抗肿瘤活性较弱。笔者研究竹柏果挥发油成分，发现竹柏果皮中含有能显著抑制人鼻咽癌CNE细胞增殖作用的成分。因此，具有丰富资源的瑶药竹柏值得进一步深入研究和开发。

[1] 戴斌.中国现代瑶药[M].南宁：广西科学技术出版社，2009：257-259.

[2] 国家中医药管理局.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：812-814.

[3] 徐亚明，方圣鼎.罗汉松科植物中化学成分的研究Ⅰ——竹柏中的抗肿瘤成分[J].化学学报，1989，47(11)：1080-1086.

[4] KUBO I，MUROI H，HIMEJIMA M.Combination effects of antifungal nagilactones againstCandidaalbicans and two other fungi with phenylpropanoids[J].J Natural Products，1993，56(2)：220-226.

[5] ZHANG Y，TANG C P，SOB S T，et al.Two new cyclope-ptides fromPodocarpusnagi[J].Chin J Chem，2012，30(6)：1361-1363.

[6] 杨荣兵，袁旭江，杜红光.竹柏叶中挥发油GC-MS分析[J].亚太传统医药，2008，4(5)：51-52.

[7] BHARDWAJ V，TADINADA S M，JAIN A，et al.Biochanin A reduces pancreatic cancer survival and progression[J].Anticancer Drugs，2014，25(3)：296-302.

[8] 刘晓宇，陈旭冰，陈光勇.β-石竹烯及其衍生物的生物活性与合成研究进展[J].林产化学与工业，2012，32(1)：104-110.

[9] MONZOTE L，STAMBERG W，STANIEK K，et al.Toxic effects of carvacrol，caryophyllene oxide，and ascaridole from essential oil ofChenopodiumambrosioides on mitochondria [J].Toxicol Appl Pharm，2009，240(3)：337-347.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.011

Studies on Volatile Constituents and Their Anti-tumor Activities from the Peel and Shell ofPodocarpusnagiFruits

LIAO Zeyong1, WEI Wei2

(1.BotanicalGardenofMedicinalPlant,GuangxiZhuangAutonmousRegion,Nanning530023,China;2.OrthopedicsHospital,GuangxiZhuangAutonmousRegion,Nanning530012,China)

Objective To compare the volatile constituents and anti-tumor activity from the peel and shell parts ofPodocarpusnageiafruits. Methods Steam distillation was used for extracting volatile oil from the peel and nutshell ofPodocarpusnageia, and gas chromatography-mass spectrometry was exploited to compare the chemical compositions.Their anti-tumor activities were studied by the MTT assay. Results The yield of volatile oil from nageia peel was 0.23%.The total of 21 kinds of composition were isolated and 18 kinds were identified, the main composition was caryophyllene, accounting for 72.44% contents of the total volatile oil.The volatile oil from nageia nutshell was 0.15%.Fifteen kinds of composition were isolated and 13 species were identified from the nutshell.Four compositions were found in both two parts.The volatile oil from both of nageia peel and nutshell inhibitted nasopharyngeal carcinoma cells proliferationinvitro, and theIC50were 54.58 and 114.83 μg·mL-1, which indicated that the volatile oil from the peel showed stronger inhibitory activity. Conclusion The main components in the volatile oil from nageia fruit are alkenes, alcohols and terpenes.The volatile oil extracted from peel shows comparable stronger anti-tumor activity.

Podocarpusnagi; Volatile oil; Chemical components; Anti-tumor activity

2014-03-12

2014-05-09

廖泽勇(1984-)，男，湖南郴州人，助理研究员，硕士，研究方向：中药药效学。电话：0771-5611352，E-mail：ijoding@qq.com。

R282.71；R285.5

B

1004-0781(2015)05-0609-04