青蒿琥酯对糖尿病肾病大鼠肾功能和单核细胞趋化蛋白-1及肿瘤坏死因子-α的影响*

聂寒，苏珂，龙艳，蒋姗姗

(桂林医学院附属医院内分泌科，桂林 541000)

青蒿琥酯对糖尿病肾病大鼠肾功能和单核细胞趋化蛋白-1及肿瘤坏死因子-α的影响*

聂寒，苏珂，龙艳，蒋姗姗

(桂林医学院附属医院内分泌科，桂林 541000)

目的 观察青蒿琥酯对糖尿病肾病大鼠肾功能及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法 雄性斯泼累格·多雷(SD)大鼠36只，随机分为6组，每组6只：正常对照组，模型对照组，青蒿琥酯小剂量组(10 mg·kg-1·d-1)、中剂量组(20 mg·kg-1·d-1)、大剂量组(30 mg·kg-1·d-1)，依那普利组(10 mg·kg-1·d-1)。采用高糖高脂饮食联合一次性腹腔注射小剂量链脲佐菌素法建立2型糖尿病肾病模型。分别干预8周后，检测各组大鼠血糖、24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮等评估肾功能情况；光镜下观察肾组织病理形态学变化；检测大鼠血清MCP-1、TNF-α水平。结果 与模型对照组比较，各治疗组24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮、血糖均一定程度下降(均P<0.01)，尤以青蒿琥酯中、大剂量组下降更显著(均P<0.01)。模型对照组MCP-1及TNF-α的含量分别为(181.71±23.06)，(3.98±0.24) pg·mL-1；青蒿琥酯小剂量组分别为(157.47±38.53)，(3.14±0.38) pg·mL-1，中剂量组分别为(138.65±18.03)，(2.58±0.11) pg·mL-1，大剂量组分别为(105.09±12.64)，(2.25±0.16) pg·mL-1，均显著降低(均P<0.05)。结论 青蒿琥酯对2型糖尿病肾病具有一定的治疗作用，其机制可能部分是通过减少炎性因子MCP-1、TNF-α的分泌，抑制肾脏炎性反应，调节肾功能，缓解肾脏的病理损伤，从而延缓肾脏病变的发展。

青蒿琥酯；肾病，糖尿病；肿瘤坏死因子；单核细胞趋化蛋白

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病导致的全身微血管并发症之一，具有较高的致死致残率，其发病机制复杂。机体内持续性慢性低度炎症状态参与DN的发生发展，单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein -1，MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)被认为可能参与其发病过程[1-3]。青蒿琥酯是青蒿素的半合成衍生物，具有广泛的生物学作用，如抗疟疾、抑制细胞增生、免疫调节、抗血管增生作用，近年发现该药还具有抗炎作用[4]。笔者在本实验中通过用高糖高脂饮食联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)复制DN模型大鼠，观察青蒿琥酯对其肾功能及血清MCP-1、TNF-α的影响，从而为临床治疗DN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 健康6～8周龄斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级雄性大鼠36只，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(湘)2011-0003，动物合格证号：2013DW001，STZ(美国Sigma公司生产，批号：S0130)，青蒿琥酯(桂林南药股份有限公司，批号：AS121002)，马来酸依那普利(扬子江药业集团，批号：14010601)，酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂龙艳(1963-)，女，广西桂林人，教授，主任医师，硕士生导师，硕士，研究方向：糖尿病及其并发症的诊治。电话：(0)13707731966，E-mail：ly136988@163.com。

盒(武汉博士德生物有限公司生产，批号：ASAb20131205)，大鼠血肌酐、尿素氮检测试剂(南京建成生物工程研究所提供，批号：C011-1)。

1.2 DN模型建立及给药方法 将36只大鼠适应性饲养1周，喂养期间每周测量大鼠体质量，1周后分为正常对照组(n=6)和高糖高脂组(n=30)。高糖高脂组予高糖高脂饮食(70%基础饲料+15%猪油+10%白糖+5%蛋黄粉)饲养8周后形成胰岛素抵抗后继续高糖高脂饲料喂食2 d后，大鼠禁食14 h不禁水，腹腔一次性注射小剂量STZ(1%溶液，剂量40 mg·kg-1)诱导糖尿病模型。72 h后尾静脉采血，测大鼠随机血糖≥16.7 mmol·L-1，判断2型糖尿病模型复制成功[5-6]。符合2型糖尿病模型的大鼠继续喂养4周，每周测定血糖1次，测体质量1次，4周后测定实验组尿量大于原尿量50%，24 h尿蛋白排泄量>30 mg视为2型糖尿病肾病模型制备成功。将符合标准的模型大鼠30只随机分为5组，每组6只：模型对照组、青蒿琥酯小剂量组(10 mg·kg-1·d-1)、青蒿琥酯中剂量组(20 mg·kg-1·d-1)、青蒿琥酯大剂量组(30 mg·kg-1·d-1)、依那普利组(10 mg·kg-1·d-1)，其中青蒿琥酯小、中、大剂量组大鼠是根据本课题前期预实验总结得出的用药剂量给药，依那普利组大鼠给药剂量是依据临床上常规用量，再通过人与大鼠的体表面积换算给药，共干预8周。整个实验过程不用胰岛素，防止外源性胰岛素对实验的干扰。

1.3 标本制备及检测方法 血糖采用德国罗氏卓越型血糖仪及试纸检测。观察大鼠的精神状态、大小便、体质量及活动情况。实验结束前1 d，用代谢笼收集24 h尿量，用放射免疫化学法测定24 h尿蛋白。所有大鼠禁食10 h后，称体质量，测空腹血糖后，腹腔注射10%水合氯醛(0.3×10-2mL·g-1)麻醉从心脏采血，取血4～5 mL，室温下静置1 h后3 000 r·min-1(r=10 cm)的速度4 ℃离心10 min，取上层血清，采用ELISA法检测各组血清MCP-1、TNF-α的表达，严格按照试剂盒说明书操作。肾组织形态学观察采用普通肾脏病理学苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色，由桂林医学院附属医院病理科完成。

2 结果

2.1 大鼠一般状态的比较 大鼠造模后均出现多食、多饮及明显消瘦等高代谢症候群，并出现毛色发黄、倒伏，活动减少；随着时间的延长，个别大鼠出现足部感染、溃烂、腹部皮肤破裂等糖尿病各种慢性并发症状。经过药物干预后，各治疗组上述症状均有不同程度减轻，以青蒿琥酯大剂量效果更好。

2.2 大鼠血糖、24 h尿蛋白及血液生化指标的比较 与正常对照组比较，模型对照组大鼠血糖、24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮显著上升(P<0.01)，药物干预后，各治疗组血糖明显下降(F=113.15，P<0.01)。各治疗组24 h尿蛋白的排泄量及血肌酐、尿素氮均较模型对照组有不同程度改善(F=476.78，98.87，52.56，P<0.01)，而青蒿琥酯中、大剂量肾功能的改善效果优于青蒿琥酯小剂量组和依那普利组(P<0.01)，青蒿琥酯小剂量组与依那普利组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3 各组大鼠血清MCP-1及TNF-α水平的比较 模型对照组大鼠血清MCP-1及TNF-α含量较正常对照组明显上升(P<0.01)，各治疗组较模型对照组均明显下降(F=266.61，117.67，P<0.01)；青蒿琥酯大剂量组血清TNF-α含量较青蒿琥酯小剂量组及依那普利组下降更明显(P<0.05)，青蒿琥酯大剂量与中剂量差异无统计学意义(P>0.05)。 各治疗组血清MCP-1含量显著降低(P<0.05)，但依那普利组与青蒿琥酯大剂量组差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4 各组大鼠肾脏病理变化的影响 正常对照组可见正常的肾小球及肾小管，结构清晰。模型对照组大鼠肾小球肥大，肾小球基底膜增厚，系膜区重度增厚，系膜细胞广泛增生，使毛细血管管腔变窄，其内有较多的炎性细胞浸润。肾小球内可见DN典型的特征性改变K-W结节出现。肾小管上皮细胞空泡样变性、间质水肿。依那普利肾小球系膜区中度增厚，系膜细胞中度增生，较少出现炎性细胞浸润。肾小管上皮细胞较少出现变性。青蒿琥酯小、中剂量组肾小球基底膜轻、中度增厚，系膜细胞轻度增生，肾小管上皮细胞基本正常。青蒿琥酯大剂量组上述形态改变有明显改善(图1)。

3 讨论

DN是一种复杂的慢性疾病，是糖尿病常见的并发症，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。随着人口老龄化进程的日渐加速，DN已经成为影响人类身心健康的重要问题[7-9]。其病变特点不仅在临床表现和疾病进程方面有别于其他免疫介导的肾脏疾病，而且一旦出现肾功能损害，其进展程度亦快于非DN患者。关于DN的发病机制复杂多样，目前尚未形成一个统一的理论机制，其经典的发病机制包括：血流动力学改变、氧化应激与糖代谢紊乱、胰岛素抵抗、细胞因子的作用，近几年发现体内持续性慢性低度炎症反应参与DN的发生发展[10]。有学者提出DN可能是代谢及免疫共同作用导致的炎症性疾病，其炎症病变的中心环节是单核/巨噬细胞在病变部位的炎性浸润，加速肾脏炎症病变的进展[11]。

表1 6组大鼠血糖、24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮水平比较

Tab.1 Comparison of blood glucose，24-hour urine protein，serum creatinine and urea nitrogen among six groups of rats±s

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.01；与青蒿琥酯小剂量组比较，*3P<0.05，*4P<0.01；与依那普利组比较，*5P<0.05；与青蒿琥酯中剂量组比较，*6P<0.01，*7P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01;compared with low-dose artesunate group，*3P<0.05，*4P<0.01；compared with enalapril group，*5P<0.05；comparison with medium-dose artesunate group，*6P<0.01，*7P<0.05

表2 6组大鼠血清MCP-1与TNF-α的含量比较

Tab.2 Comparison of the serum levels of MCP-1 and TNF-α among six groups of rats±s，pg·mL-1

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.01；与青蒿琥酯小剂量组比较，*3P<0.05；与青蒿琥酯中剂量组比较，*4P<0.05；与依那普利组比较，*5P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01;compared with low-dose artesunate group，*3P<0.05；compared with medium-dose artesunate group，*4P<0.05；compared with enalapril group，*5P<0.05

MCP-1属于趋化因子超家族的CC亚族(β-亚族)，MCP-1通过激活及趋化单核/巨噬细胞，促进肾小球基底膜增厚、诱导肾小球系膜细胞增生、细胞外基质沉积，加速肾小球的硬化，导致DN的肾脏病理改变，加速肾脏病变进程[12-14]。潘国伟等[15]研究证实DN大鼠不仅尿中的MCP-1水平升高，血清中的MCP-1水平也相应升高，同时尿蛋白量增加，其程度与血清中MCP-1升高程度成线性正相关，并与肾病的严重程度保持一致。可以证实单核巨噬细胞浸润导致的机体内炎症状态可能是DN发病的重要机制之一。TNF-α主要有巨噬细胞产生的炎性因子，能促进巨噬细胞浸润至受损的肾间质，并诱导巨噬细胞的促纤维化因子释放增加，加剧肾间质的免疫炎症反应，引起肾小管上皮细胞水肿、变性[16]。研究发现，受损的肾小管上皮细胞较正常的细胞能分泌更多的TNF-α，并能促进肾间质成纤维细胞增生，进一步加速肾脏间质纤维化的形成[17]。

青蒿琥酯不仅具有传统意义上的生物活性，还具有炎症抑制作用，莫汉有等[18]将其应用于佐剂性关节炎大鼠的模型研究中发现它可以降低血清中炎性因子MCP-1、TNF-α的表达，阻止炎性细胞侵袭靶组织，抑制关节炎的发生。杜志峰等[19]得出的结论也与此一致，充分证实了青蒿琥酯对大鼠类风湿关节炎具有抑制作用。但是对于其在肾脏疾病中的应用鲜有报道。

本实验通过高糖高脂饮食联合一次性腹腔注射小剂量STZ的经典造模方法成功复制2型糖尿病肾病模型，用药物干预后发现青蒿琥酯能够改善DN大鼠体质量减轻、体毛粗糙、精神萎靡、各种感染等整体状态；DN大鼠24 h尿蛋白含量明显下降，同时能降低DN大鼠血肌酐、尿素氮水平，改善肾功能。本研究发现DN模型对照组肾小球出现典型的肾脏病理改变即K-W结节，肾小球系膜细胞及基质增生，肾小管空泡样变性，肾间质炎性细胞浸润，间质血管管腔变窄。而青蒿琥酯能够减轻上述病理形态的改变，同时降低TNF-α和MCP-1的水平，说明青蒿琥酯对DN肾脏具有保护作用，其部分机制可能是通过改善DN大鼠肾功能，减轻肾脏病理改变，抑制炎性细胞因子的释放，减轻肾脏炎症反应，从而缓解肾脏病变的进展。本实验通过将青蒿琥酯应用于DN动物模型，对其肾脏的作用及其机制进行初步探讨，为临床上治疗DN提供一种新的思路。

A.正常对照组； B.模型对照组；C.依那普利组；D.青蒿琥酯小剂量组；E.青蒿琥酯中剂量组；F.青蒿琥酯大剂量组

图1 6组大鼠肾脏病理形态学改变(×200，HE染色)

A.normal control group；B.model control group；C.enalapril group；D.low-dose artesunate group；E.medium-dose artesunate group；F.high-dose artesunate group

Fig.1 Pathological changes in the kidneys of six group of rats(×200，HE staining)

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.007

Influences of Artesunate on Renal Function and MCP-1,TNF-α of Diabetic Nephropathy Rats

NIE Han，SU Ke，LONG Yan，JIANG Shanshan

(DepartmentofEndocrinology,theHospitalAffiliatedtoGuilinMedicalCollege，Guilin541000，China)

Objective To investigate the effects of artesunate(Art) on renal function and the expression of monocyte chemotactic protein-1(MCP-1)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in rats with type 2 diabetic nephropathy(DN). Methods Thirty six male SD rats were randomly divided into six groups, six rats in each, as the normal control, model control, low-dose of Art, middle-dose of Art, high-dose of Art groups which were intragastrically administrated with Art at the dose of 10, 20 and 30 mg·kg-1·d-1for consecutive 8 weeks, enalapril group, which were intragastrically administrated with enalapril 10 mg·kg-1·d-1for consecutive 8 weeks. Rats were injected with low dosage of streptozotocin and fed with high fat and high sugar diets to establish type 2 diabetic nephropathy rat model. After 8 weeks’ treatment, the plasma glucose, 24-hour urine protein, serum creatinine and blood urea nitrogen were measured to evaluate renal function.The pathological morphology of rats was performed.Immunohistochemistry and enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) were performed to examine the expression levels of MCP-1 and TNF-α,respectively. Results Compared with the model control group, 24-hour urine protein, serum creatinine, blood urea nitrogen and blood glucose were significantly decreased in the treatment groups (P<0.01).Art significantly decreased the serum expressions of MCP-1 and TNF-α in low-,middle-,high-dose of Art group(157.47±38.53,138.65±18.03,105.09±12.64 and 3.14±0.38,2.58±0.11,2.25±0.16) pg·mL-1, compared with model control group(181.71±23.06 and 3.98±0.24) pg·mL-1(P<0.05). Conclusion Art has beneficial effects on type 2 diabetic nephropathy.The mechanism of which may be related to the inhibition of inflammatory factor MCP-1 and TNF-α，further relieve the pathological injury of kidney and delay the progress of diabetic nephropathy to some extent.

Artesunate; Nephropathy, diabetic; Tumor necrosis factor-α; Monocyte chemotactic protein-1

2014-04-14

2014-07-13

*广西医疗卫生适宜技术研究与开发项目(S201316-07)；广西自然科学基金项目(2012GXNSFAA053085)

聂寒(1987-)，女，湖北黄冈人，硕士，研究方向：糖尿病及其并发症。电话：(0)18377332387，E-mail：1054439086@qq.com。

苏珂(1960-)，男，广西桂林人，教授，主任医师，硕士，硕士生导师，研究方向：糖尿病及其并发症的诊治。电话：(0)13978316336，E-mail：su13978316336@163.com。

R282.71；R285.5

A

1004-0781(2015)05-0593-05