新型Rho激酶抑制剂FSD-C11化合物抑制EAE的作用研究

于婧文 李艳花 张辉 丁智斌 尉杰忠 刘春云 杨婉芳 冯前进 黄建军 赵永飞 肖保国 马存根

新型Rho激酶抑制剂FSD-C11化合物抑制EAE的作用研究

于婧文 李艳花 张辉 丁智斌 尉杰忠 刘春云 杨婉芳 冯前进 黄建军 赵永飞 肖保国 马存根

目的 探索新型Rho激酶抑制剂FSD-C11化合物治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的有效性及可能的作用机制，为今后可能的临床治疗提供实验依据。方法 采用小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)多肽诱导雌性C57BL/6小鼠建立EAE模型，于免疫后第3天起FSD-C11组按体质量40 mg/(kg·d)腹腔注射FSD-C11化合物，EAE组注射等量生理盐水，实验期间每天定时记录两组小鼠临床症状评分及体质量变化。免疫后第28天取小鼠脊髓进行HE和髓鞘染色，流式细胞术检测脾细胞M1和M2型巨噬细胞表型，Western blot检测脑组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和磷酸化核蛋白因子κB(p-NF-κB)的表达。结果 FSD-C11化合物可延迟小鼠的起病时间，降低发病率，减轻临床症状，减少体质量丢失；与EAE组小鼠相比，FSD-C11可减少脊髓炎性细胞浸润和髓鞘脱失(P<0.05)；抑制致炎性的M1型巨噬细胞，增加抗炎性和保护性的M2型巨噬细胞；抑制脑组织中iNOS和p-NF-κB蛋白的表达。结论 新型Rho激酶抑制剂FSD-C11化合物在治疗EAE中显现出很好的潜力，其作用机制可能与调节巨噬细胞极性、抑制炎性反应有关。

多发性硬化；Rho相关激酶类；法舒地尔；FSD-C11化合物；脑脊髓炎，自身免疫性，实验性

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的病理特征为脑白质内神经髓鞘脱失、轴突变性及炎性细胞浸润。实验性自身免疫脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE)与MS的临床表现、免疫及病理特征相似，是目前国际公认的研究MS动物模型。在EAE模型中，脊髓中浸润的炎性细胞主要是T细胞和巨噬细胞。T细胞在MS/EAE发病过程中起关键作用。疾病的发生发展与Th1/Th2[1]、Th17/Treg[2]平衡失调有关。Th1和Th17促进炎性反应，加速EAE/MS进程，而Th2和Treg则抑制炎性和缓解疾病严重程度。近期研究发现，巨噬细胞M1/M2的失衡在EAE/MS促炎和抗炎中也发挥重要作用[3]。巨噬细胞根据活化状态和功能不同，分为致炎性的M1型巨噬细胞和抗炎性的M2型巨噬细胞[4]。M1型巨噬细胞的表型标志物有CD16/32、IL-12、iNOS、CD40等，M2型巨噬细胞的标志物有CD206、IL-10、Arg-1、CD14和CD23等[5-6]。巨噬细胞影响T细胞的分化，M1型巨噬细胞影响Th1/Th17的平衡，介导炎性免疫反应，而M2型巨噬细胞则抑制M1细胞，参与神经炎性反应和Th2反应[7]。抑制M1细胞，降低炎性细胞因子的分泌，或者促进M2细胞的分化，则能缓解EAE发病严重程度。

盐酸法舒地尔(Fasudil hydrochloride)在临床上主要治疗蛛网膜下腔出血后血管痉挛，其在治疗多种神经退行性疾病例如MS[8]、阿尔茨海默病[9]和肌萎缩侧索硬化[10]等具有一定的潜能。大量实验研究显示Fasudil是一种有效的Rho激酶抑制剂，可抑制炎性反应，减轻炎性细胞浸润，下调外周T细胞活性，促进神经轴突再生，改善神经系统疾病的临床症状[11]。尽管Fasudil有一定的临床治疗潜能，但因其具有安全窗小的缺点并不适合MS患者的长期使用。已有研究推荐腹腔注射Fasudil最大剂量为800 μg/(只·d)[12]。本研究前期实验经过筛选大量Rho激酶抑制剂Fasudil衍生物发现， FSD-C11化合物能有效抑制EAE的临床症状。本研究对FSD-C11治疗EAE的有效性及作用机制进行了初步探讨，旨在为今后其可能的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物与材料 雌性C57BL/6小鼠8～10周龄，体质量18～20 g，购自北京维通利华公司，经山西大同大学伦理委员会批准，所进行的实验遵守国际动物实验委员会指导方针。实验前小鼠在无病原菌动物房清洁级饲养(25 ℃左右)，自由饮食喂养1周。主要试剂和仪器包括小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55，西安联美生物科技有限公司合成)、完全福氏佐剂(Sigma公司)、百日咳毒素(PTX，ENZO公司)、结核分枝杆菌(TB，DIFCO公司)、流式细胞仪(BD FACS Calibur公司)、Bio-RAD凝胶成像分析(Bio-RAD公司)、BCA蛋白定量试剂盒(欣科中晶生物技术有限公司)、ECL化学发光试剂盒(Millipore公司)、FSD-C11化合物(天津红日药业股份有限公司馈赠)。

1.2 方法

1.2.1 EAE模型制备及分组：将MOG35-55肽段5 mg溶于1 mL生理盐水中，将6 mg TB溶于1 mL完全福氏佐剂(其中1 mL的完全福氏佐剂已含有1000 μg的TB)；采用针管混合器将两种溶液体等体积充分混合为油包水样乳白色混悬液，乳剂静置后无分层即为合格。将小鼠按体质量随机分为EAE组和FSD-C11组，每组各6只，皮下注射MOG35-55福氏完全佐剂0.1 mL/只(相当于每只小鼠注射MOG 250 μg，TB 350 μg)。于免疫当天和48 h后，分别给予两组小鼠腹腔注射PTX 750 ng。于免疫后第3天，FSD-C11组小鼠按体质量40 mg/(kg·d)给予FSD-C11化合物腹腔注射，EAE组以同样方式给予等量生理盐水，直至免疫后27 d。每天定时对小鼠称重和进行临床症状评分。临床评分采用国际通用的5分评分制进行：无任何临床症状计为0分；尾部张力消失，可见轻度步态笨拙计为1分；一侧后下肢无力，被动翻身后可以恢复计为2分；双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动计为3分；双侧后肢瘫痪伴前肢瘫痪计为4分；濒死状态或死亡计为5分[13]。症状介于两个标准之间者以±0.5分计。累积临床评分为组内每只小鼠自发病当天起(疾病评分≥1)至实验结束评分的总和[14]。累积疾病指数为每天组内小鼠临床评分总和的均数[15]。

1.2.2 标本采集：免疫后28 d，采用0.3%(质量浓度)戊巴比妥钠按0.2 mL/只腹腔注射麻醉小鼠后取脾脏，制备单个核细胞悬液。各组3只快速冰上取脑组织提取蛋白，定量后采用Western blot技术检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和磷酸化核蛋白因子κB(p-NF-κB)；各组另3只用4%(质量浓度)多聚甲醛灌流进行体内组织固定，分离脊髓，包埋后做冷冻切片，进行髓鞘和HE染色。

1.2.3 HE染色和髓鞘染色：将脊髓冷冻切片水中浸泡2 min，苏木精染色4 min，快速水洗，0.5%(体积分数)盐酸乙醇分化15 s，0.5%(质量浓度)伊红染色30 s，快速水洗，梯度乙醇脱水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性树胶封片，光镜下观察炎性细胞浸润情况。取冷冻切片于70%(体积分数)乙醇中浸泡15 min，浸于固蓝液中，56 ℃孵育36 h，于95%乙醇(体积分数)溶液浸洗10 min，去离子水浸洗5 min，0.05%(质量浓度)碳酸锂快速浸洗10 s，70%(体积分数)乙醇分化至灰质与白质能够清晰辨别，去离子水浸洗5 min，梯度乙醇脱水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性树胶封片，光镜下观察髓鞘脱失情况。用Image-Pro Plus软件，计数小鼠整个脊髓白质区的炎性细胞数并求其平均值，计算小鼠髓鞘脱失面积与白质面积比值并求均值。

1.2.4 流式细胞术检测：小鼠脾细胞悬于50 μL 0.1%皂苷/1% BSA-PBS或1% BSA-PBS(均为质量浓度)缓冲液中，分别加1 μL 荧光素标记抗体，包括Flour-488-F4/80、PE-CD16/32和PE-CD206抗体(BD公司)，室温避光20 min。然后PBS洗1次，置500 μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪进行检测M1型巨噬细胞标志物CD16/32，M2型标志物CD206。

1.2.5 Western blot检测：用组织裂解液在4 ℃条件下充分裂解脑组织蛋白，并用BCA法测定蛋白含量。制备蛋白上样缓冲液样品，用10%(质量浓度)SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。电泳完毕后，将分离好的蛋白凝胶用湿式转移法转移到PVDF膜(稳流200 mA，2 h)。5%(质量浓度)脱脂奶粉封闭，加入兔抗小鼠iNOS抗体(1∶1000)，兔抗小鼠p-NF-κB抗体(1∶1000)，兔抗小鼠GAPDH抗体(1∶5000)，4℃过夜。次日洗涤后孵育HRP耦联的二抗(1∶1000)室温45 min。洗膜后进行化学发光反应，用Bio-RAD凝胶成像分析仪检测条带，测定iNOS和p-NF-κB蛋白表达量，用蛋白条带光密度与内参GAPDH的光密度比值表示。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0统计软件对实验数据进行分析处理。符合正态分布的计量数据均采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠临床症状和体质量比较 EAE组小鼠于免疫后第10天开始陆续发病，发病率为100%。FSD-C11组于免疫后第13天陆续发病，发病率为66.67%。与EAE组比较，FSD-C11组小鼠起病时间推迟，临床症状改善，体质量升高(表1、图1)。

2.2 小鼠脊髓炎性细胞浸润和髓鞘脱失变化 HE染色结果显示EAE组小鼠脊髓白质区大量炎性细胞浸润，以腰膨大处炎性细胞浸润最为明显，而FSD-C11组明显较少(图2)。EAE组白质区炎性浸润细胞数目高于FSD-C11组(628.33±182.08 比 35.00±29.51)(P<0.05)。髓鞘染色结果显示，EAE组小鼠脊髓白质出现明显的髓鞘脱失，而FSD-C11则可有效改善髓鞘的脱失(图2)。FSD-C11组髓鞘脱失面积与白质面积比值较EAE组降低〔(4.69±1.79)% 比(20.71±5.53)%〕(P<0.05)。

2.3 流式细胞术检测结果 FSD-C11组CD16/32与EAE组相比表达量显著减少，而CD206的表达量则增加，而CD16/32与CD206的比值也显著降低(图3、表2)。

表 1 EAE组与FSD-C11组小鼠发病情况

注：EAE：实验性自身免疫性脑脊髓炎，图1～4、表2同；与EAE组比较，*P<0.05

注：与EAE组比较，*P<0.05，**P<0.01

图1 两组小鼠免疫后不同时间临床症状评分和体质量变化趋势

图2 两组小鼠脊髓炎性细胞浸润(HE染色)及髓髓鞘脱失情况比较(髓鞘染色)

图3 两组小鼠M1型和M2型巨噬细胞流式细胞图

2.4 各组小鼠脑iNOS和p-NF-κB的表达 FSD-C11组iNOS和p-NF-κB的相对表达水平均低于EAE组(P<0.05)(图4)。

iNOS:诱导型一氧化氮合酶；p-NF-κB：磷酸化核蛋白因子κB；与EAE组比较，*P<0.05

图4 两组小鼠脑iNOS和p-NF-κB的表达(Western blot)

表 2 两组小鼠脾细胞M1型、M2型巨噬细胞标志物CD16/32、CD206表达情况

注：与EAE组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

目前研究认为，MS是遗传因素与环境因素相互作用而导致的自身免疫性疾病，多呈现复发-缓解的特点。根据其发病的特点，MS急性期治疗首选药物糖皮质激素，缓解期治疗采用经FDA批准的药物，如干扰素β、醋酸格列默、米托蒽醌和那他珠单抗。上述药物虽然可以减少MS复发次数，改善病灶严重程度，延缓患者残疾进展速度，但短期和长期使用都会产生不良反应[16-17]。

前期研究已证实，Fasudil不但具有推迟EAE起病，改善临床症状，减少体质量丢失和髓鞘脱失和炎性细胞浸润[18]，下调NF-κB[19]和抑制Occludin的表达[20]，还可促进EAE小鼠神经轴突再生，降低血管通透性[21]。腹腔注射或口服Fasudil 都可在一定程度上改善EAE的严重程度[19,22]。Fasudil静脉剂型不适合MS患者的长期使用，而口服途径虽然安全简便但治疗效果还待提高。同时Fasudil还存在安全窗小，剂量大副作用明显的缺点。因此，筛选Rho激酶抑制作用更好和选择性更强的新型衍生物是目前研究者们努力的方向[23]。目前正在研究的Rho激酶抑制剂有异喹啉磺酰胺类、4-氨基吡啶类、1H-吲哚类等[24]。Fasudil属于异喹啉磺酰胺类衍生物。通过对Fasudil的结构优化，筛选出新的化合物FSD-C11可延迟EAE小鼠起病时间，降低发病率，缓解高峰期发病的严重程度，减少体质量丢失；减少炎性浸润细胞数量，抑制髓鞘脱失，抑制iNOS和p-NF-κB的表达。

巨噬细胞与EAE的发展有密切关系，它有抗原提呈的能力，分泌炎性细胞因子，参与髓鞘脱失和轴突的损伤。MS/EAE发展的过程中，促炎细胞因子激活中枢神经系统的小胶质细胞和外周巨噬细胞，放大中枢神经系统炎性反应。体内[25]和体外[3]实验都证实， EAE病理过程中有M1型巨噬细胞的活化。M1/M2型巨噬细胞的平衡是炎性反应程度的重要指标[7]。M1型巨噬细胞向M2型的极化可显著改善EAE严重程度[26]。经Fasudil干预的小鼠EAE模型M1型巨噬细胞表面标志物iNOS、TLR-4和CD16/32等表达减少，而M2型巨噬细胞标志物CD206和Arg-1表达增加，通过调节细胞极化，从而达到改善疾病的目的[3]。FSD-C11也可促进巨噬细胞向M2型转化，抑制炎性反应，直接或间接地控制T细胞的表达，抑制Th1/Th17的表达，形成一个抑制炎性反应和髓鞘修复的微环境。

综上所述，FSD-C11化合物可有效改善EAE的临床症状，抑制中枢神经系统炎性病灶并改善髓鞘脱失，其作用机制可能与调节巨噬细胞的极性，抑制炎性反应和改善炎性微环境有关。因此，有必要对FSD-C11化合物进行深入研究，包括其安全窗和毒副作用，以便为今后临床使用其治疗MS以及其他神经变性疾病提供实验依据。

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(本文编辑：时秋宽)

Suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by FSD - C11, a novel Rho kinase inhibitor

YUJingwen,LIYanhua,ZHANGHui,DINGZhibin,YUJiezhong,LIUChunyun,YANGWanfang,FENGQianjin,HUANGJianjun,ZHAOYongfei,XIAOBaoguo,MACungen*#.

*InstituteofBrainScience,ShanxiDatongUniversity,Datong037009;#“2011”CollaborativeInnovationCenter/DepartmentofEncephalopathyandNationalMajorClinicalDepartmentofMinistryofHealth,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,TaiyuanShanxi030024,China

MA Cungen, Email:macungen2001@163.com

Objective We observed the therapeutic effect of FSD - C11 and its mechanisms in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). FSD - C11 is a novel Rho kinase inhibitor that is derived from Fasudil hydrochloride. Methods Chronic EAE was induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides 35-55 (MOG35-55) in female C57BL/6 mice. FSD-C11 compound was injected intraperitoneally at 40 mg/(kg·d) from day 3 post-immunization (p.i) to day 27 p.i, and physiological saline was injected in control group. Clinical symptoms and body weight of mice were recorded on time every day. On day 28 p.i, the mice were sacrificed and spinal cords were obtained for HE and myelin staining. Splenocytes were separated, CD16/32 and CD206 were detected by flow cytometry. Protein extracting from brain was collected to detect the expression of nitric oxide synthase (iNOS) and nucleoprotein factor p-NF-κB by western blot. Results FSD-C11 ameliorated the clinical severity of EAE, decreased the incidence of disease, and reduced the loss of body weight. Compared with the control group, FSD-C11 reduced the spinal inflammatory cell number and demyelination (P<0.05). Macrophages in the FSD-C11 group shifted M1 to M2 phenotype. FSD-C11 group showed decreased inflammatory responses, increased anti-inflammatory responses, and inhibited expression of iNOS and p-NF-κB in the brain. Conclusions FSD-C11, as a novel Rho kinase inhibitor, exhibited therapeutic potential in EAE. Its mechanism may be related to regulating macrophages polarity and inhibit inflammatory reaction.

multiple sclerosis; rho-associated kinases; Fasudil; FSD-C11 compound; encephalomyelitis, autoimmune, experimental

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.03.002

国家自然科学基金2012年面上项目(81272163)；山西中医学院“2011”培育计划项目(2011PY-1)；山西省国际科技合作项目(2013081058)；山西省自然科学基金项目(2008011082-1)；山西大同大学博士启动项目(2011-B-11)

037009 山西大同大学脑科学研究所(于婧文、李艳花、张辉、丁智斌、尉杰忠、刘春云、肖保国、马存根)；030024 山西中医学院“2011”协同创新中心/国家卫生部临床重点专科(脑病科)(杨婉芳、冯前进、马存根)；大同煤矿集团平旺医院神经外科(黄建军)；复旦大学华山医院神经病学研究所(赵永飞、肖保国)

马存根，Email:macungen2001@163.com

R744.5

A

1006-2963 (2015)03-0156-06

2014-11-03)