全身型重症肌无力患者异常胸腺microRNA表达谱的初步研究

邱笛 李劲频 莫雪安 陈泽志 杜伟伟 刘竞丽

全身型重症肌无力患者异常胸腺microRNA表达谱的初步研究

邱笛 李劲频 莫雪安 陈泽志 杜伟伟 刘竞丽

目的 比较全身型重症肌无力(generalized myasthenia gravis，GMG)患者异常胸腺(胸腺瘤、胸腺增生)与正常胸腺microRNA(miRNA)表达谱的差异，以探讨胸腺miRNA在重症肌无力发病机制中的作用。方法 应用RiboArrayTMmiRNA芯片检测技术分别比较GMG伴胸腺瘤(4例)、胸腺增生(4例)患者胸腺与正常对照(4例)胸腺miRNA表达谱的差异，并利用生物信息学预测可能受其调控的靶基因。结果 GMG胸腺瘤组、GMG胸腺增生组与正常对照组之间胸腺miRNA聚类分析树状图差异明显；GMG胸腺瘤组较正常对照组显著差异表达的胸腺miRNA共有16个，其中14个下调，下调最显著的为hsa-miR-362-3p，2个上调，上调最显著的为hsa-miR-125a-5p；GMG胸腺增生组较正常对照组显著差异表达的miRNA共有38个，其中下调者37个，下调最显著的为hsa-miR-548av-3p，上调者1个，为hsa-miR-4442。结论 异常表达的胸腺miRNA可能在重症肌无力发病中起作用。

重症肌无力；胸腺瘤；胸腺增生；微RNAs；芯片分析技术；基因表达谱

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种主要累及神经肌肉接头突触后膜上乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AChR)的自身免疫性疾病[1]。至今其发病机制尚未完全阐明。较多研究结果提示胸腺免疫功能异常可能与MG的发生有关，然而其具体途径尚未阐明[2]。MicroRNA(miRNA)是一类新型保守的小分子单链非编码RNA，通过碱基互补结合到靶目标mRNA上，抑制mRNA的翻译或者降解mRNA，从而在转录后水平调控基因表达。据推测，人类基因组30%以上的基因受miRNA调控，其功能涉及细胞的增殖、成熟、分化、凋亡等生命过程，与免疫调节密切相关。研究发现miR-181a通过靶向Bcl2、CD69、T细胞抗原受体(TCR)参与胸腺中T细胞的调节过程，而miR-155通过靶向巨噬细胞活化因子(MAF)参与调节胸腺生发中心B细胞反应[3]。miRNA不仅参与机体的免疫调节，而且其表达异常还与自身免疫性疾病密切相关，已有报道显示miR-125a在系统红斑狼疮(SLE)中通过靶向肠道内富含的Kruppel样因子13(KLF13)导致SLE恶化[4]。最近研究结果显示MG患者外周血中异常表达的miRNA可能在其发病机制中起一定作用[5]。然而，目前尚未检索到关于胸腺miRNA在MG发生、发展中作用的研究。本研究运用RiboArrayTMmiRNA基因芯片检测技术，比较全身型重症肌无力(generalized MG，GMG)伴发胸腺瘤、胸腺增生患者与正常对照者胸腺miRNA表达谱的差异，并预测其靶基因，旨在探讨胸腺miRNA在GMG发病机制中的调控作用。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2012-03-2013-03广西医科大学第一附属医院心胸外科住院确诊为GMG伴发胸腺瘤或胸腺增生并行胸腺切除术的患者和无自身免疫性疾病的先天性心脏病(ASD)行开胸切除正常胸腺的患者共12例，取12份胸腺标本，其胸腺标本的病理诊断由病理科完成。(1)正常对照组4份，取自4例ASD患者〔男女各2例，平均年龄(39.0±6.1)岁〕正常胸腺组织；(2)GMG胸腺瘤组4份，取自GMG伴胸腺瘤患者〔男女各2例，平均年龄(41.0±10.1)岁，平均病程(10.0±2.3)年〕的胸腺瘤旁临近胸腺组织；(3)GMG胸腺增生组4份，取自GMG伴发胸腺增生患者〔男女各2例，平均年龄(36.0±7.3)岁，平均病程(5.0±3.0)年〕的胸腺增生旁临近胸腺组织。各组间患者年龄、性别构成比较无统计学差异。所取标本经生理盐水漂洗后立即装入冻存管放入液氮罐速冻，后转入-80℃低温冰箱待用。所有患者手术前均停止药物治疗至少1个月。本研究通过广西医科大学第一附属医院研究伦理委员会的批准。所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 包括Trizol裂解液(美国Invitrogen生命技术公司)、miRNA(v.18.0)基因芯片(广州市锐博生物科技有限公司)、GenepixPro7.0图像分析软件(美国Axon Instruments公司)、Genepix 4000B激光扫描仪(美国Axon Instruments公司)。

1.3 方法

1.3.1 胸腺组织总RNA提取及质量检测：按照RNA试剂盒说明书实验步骤，Trizol法提取胸腺标本总RNA，并检测RNA浓度，结果以吸光度〔D(λ)〕值表示，随后行RNA甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量，-70°C保存。

1.3.2 miRNA芯片检测及分析：根据总RNA的起始量选择相应的稀释比例, 依据说明书制备poly(A)Tailing Mix；进行生物素标记miRNA；取出芯片将其平衡至室温，杂交液加入到标记好的miRNA体系中，将100 μL杂交液注入至芯片中，将芯片平衡放置于杂交炉中，48℃，60 r/min旋转杂交16 h。杂交完成后进行芯片清洗染色，使用Genepix 4000B激光扫描仪进行图像采集，使用Genepix Pro 7.0图像分析软件对扫描后的图像进行背景抽离和归一化，得到标准化的数据。然后计算每个miRNA在组间差异表达的2-Foldchange值及P值。根据此标准可筛选得到各组间差异表达的miRNA。采用Cluster3.0分析软件对差异表达的miRNA进行聚类分析，并采用SAM软件统计分析获得显著差异表达的miRNA。由广州锐博有限公司提供技术平台。为保证结果的可靠性，所有送检标本均未标注样品组别，仅标注标本序号。

1.3.3 靶基因预测：运用miRecords(http://mirecords.biolead.org/)软件预测靶基因。miRecords是一种整合型数据库，对不同的数据库间的靶基因预测进行比较、整合，是较好的预测软件之一。

1.4 统计学处理 芯片数据统计学分析应用SAM&R软件；芯片聚类分析应用Cluster3.0软件，均由广州锐博有限公司完成。差异表达的标准设为：上调者其2-Fold change值>1，下调者其2-Fold change值<-1，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胸腺组织总RNA质量检测 样品总RNA经甲醛变性凝胶电泳结果显示，28S和18S电泳条带清晰，28S条带亮度约为18S条带亮度的2倍，表明RNA完整性好、无降解(图1)。其D(λ)260 nm/D(λ)280 nm>1.8，D(λ)260 nm/D(λ)230 nm>1.5，证实提取的总RNA完整性好、纯度高。

2.2 芯片检测结果 采用Cluster3.0分析软件对差异表达的miRNA进行聚类分析的结果见图2。GMG胸腺瘤组与正常对照组比较有显著差异表达的miRNA共16个(表1)，其中14个下调，下调最显著的为hsa-miR-362-3p，2个上调，上调最显著的为hsa-miR-125a-5p；GMG胸腺增生组与正常对照组比较有显著差异表达的miRNA共38个(表2)，下调者有37个，下调最显著的为hsa-miR-548av-3p，上调者1个，为hsa-miR-4442。将GMG胸腺瘤组、GMG胸腺增生组中的miRNA表达谱进行对比，发现GMG胸腺瘤组与GMG胸腺增生组变化趋势一致的miRNA共有10个(表1、2)，其中9个miRNA下调，下调最显著的为GMG胸腺增生组的has-miR-570-5p和GMG胸腺瘤组的has-miR-362-3p，1个miRNA上调(hsa-miR-4442)。

1：正常对照组；2：GMG胸腺瘤组；3：GMG胸腺增生组

图1 甲醛变性胶电凝泳检测各组胸腺组织总RNA完整性

1：正常对照组；2：GMG胸腺瘤组；3：GMG胸腺增生组标本；图中红色代表miRNA上调，绿色代表miRNA下调；右上角小图为色键图，不同颜色梯度代表不同的表达量

图2 各组胸腺miRNA聚类分析树状图

表 1 GMG患者胸腺瘤组与正常对照组显著差异表达的miRNA

注：a为log2为底转化的标准化信号值之间的比值，表示miRNA表达水平在两组之间的差异，当2-Fold change >1.0或2-Fold change<-1.0时认为miRNA表达有明显差异；b 表示GMG胸腺瘤组与GMG胸腺增生组变化趋势一致的miRNA。表2同

表 2 GMG患者胸腺增生组与正常对照组显著差异表达的miRNA

2.3 靶基因预测结果 利用miRecords靶基因预测软件，对各组最显著差异表达的miRNA进行靶基因预测。分别对hsa-miR-362-3p，hsa-miR-125a-5p，hsa-miR-548av-3p，hsa-miR-4442，has-miR-570-5p进行靶基因预测发现，其中hsa-miR-362-3p、hsa-miR-125a-5p预测到靶基因(表3、4)。

表 3 Hsa-miR-362-3p可能的部分靶基因

表 4 Hsa-miR-125a-5p可能的部分靶基因

3 讨论

近年来研究发现，miRNA在MG的发病机制中起重要作用。Cheng等[5]发现，miR-320a在MG患者外周血单核细胞(PBMC)中表达量明显下降，它通过直接作用于目标蛋白丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)参与调节促炎细胞因子白细胞介素2(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)、IL-6 和IL-17的表达。Jiang等[6]研究发现，MG患者PBMC中有21个miRNA表达升高显著，23个miRNA下降明显，其中miR-let-7c下降显著，它主要作用于IL-10 mRNA的3′端非编码区，负调控IL-10的表达。

本实验运用RiboArrayTMmiRNA芯片技术对GMG胸腺瘤组和GMG胸腺增生组患者胸腺miRNA的表达谱与对照组进行了比较发现，GMG患者胸腺miRNA表达谱与对照组相比有显著差异，通过聚类分析树状图进行区分发现，共有16个与GMG胸腺瘤相关的miRNA，其中有14个表达下调，2个表达上调，提示这16个miRNA可能与伴胸腺瘤GMG的发病机制有关。GMG胸腺增生相关的miRNA有38个，其中37个表达下调，1个表达上调，提示这些miRNA可能参与伴胸腺增生GMG的发病过程。这16个与GMG胸腺瘤相关的miRNA及38个与GMG胸腺增生相关的miRNA中，有哪些与胸腺瘤或胸腺增生的发生确切相关，哪些与MG的发病过程有关，尚需后期继续深入研究。本研究发现GMG胸腺瘤组与GMG胸腺增生组存在10个变化趋势一致的miRNA，推测这10个miRNA与GMG发病相关的可能性更大，提示胸腺瘤与胸腺增生并发GMG有部分相同的发病机制。最近Jiang等通过对比3名MG患者与3名正常人PBMC中miRNA的表达，显示MG患者PBMC中共有21个miRNA明显上调，23个miRNA下调[6]，但这44个miRNA中并不包括本实验所检测到的有明显差异表达的miRNA。这种现象的产生可能由2个原因导致：(1)由于miRNA具有组织特异性，在胸腺组织细胞种类和数目不同于PBMC，所以会出现不同的miRNA；(2)胸腺是中枢免疫器官，因此在胸腺中检测出的miRNA可能与中枢免疫调节异常有关，而外周血中的miRNA则可能与机体执行外周免疫应答相关，所以在胸腺中和外周血中检测到的miRNA种类不同。

本研究采用miRecords软件对在实验组中表达差异最显著的miRNA靶基因进行预测发现，hsa-miR-362-3p和hsa-miR-125a-5p能够预测出靶基因。然而hsa-miR-362-3p和hsa-miR-125a-5p靶基因较多，而且这些靶基因的生物学功能包括细胞周期调控、转录调控、免疫调控、信号通路的调控以及细胞的增殖、凋亡、分化等各个方面。已有研究表明，miR-362-3p通过靶向E2F1、USF2和PTPN1基因诱导细胞周期阻滞，从而在大肠癌的复发过程中起作用[7]。此外，miR-362-3p在炎性反应性肠病中异常表达，提示miR-362-3p可能参与其发病过程[8]。在单核细胞向巨噬细胞分化的过程中细胞内miR-125a-5p的表达下降，表明miR-125a-5p可能与巨噬细胞的分化有关[9]。那他珠单抗治疗多发性硬化患者6个月后血液中miR-125a-5p的表达下降，表明miR-125a-5p可以在那他珠单抗治疗多发性硬化过程中作为一种可能的评价疗效的指标[10]。这些研究提示miR-362-3p及miR-125a-5p可能与机体免疫调控有关。需要注意的是，本文预测的靶基因仅为预测软件所得，受其算法的影响预测数目太多，容易产生假阳性。最终确定miRNA的靶基因以及其对靶基因功能影响仍然需要用体外及体内的实验方法来验证[11]。

综上所述，本研究通过miRNA芯片技术检测，发现 GMG患者胸腺组织中有特异表达的miRNA存在，推测这些miRNA的功能可能与自身免疫耐受有关。然而本研究的实验样本例数较少，需进一步扩大样本量验证。深入研究这些特异改变的miRNA及其靶基因可为探索GMG的发病机制提供线索。

[1]井峰,黄旭升.重症肌无力相关抗体的研究进展[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2014,21(2):126-129.

[2]杜伟伟,李劲频,陈泽志，等.自身免疫调节因子对EAMG模型小鼠发病的影响[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2014,21(3):157-160,165.

[3]Kroesen BJ,Teteloshvili N,Smigielska-Czepiel K,et al. Immuno-miRs:critical regulators of T-cell development, function and ageing[J]. Immunology,2015,144(1):1-10.

[4]Zhao X,Tang Y,Qu B,et al.MicroRNA-125a contributes to elevated inflammatory chemokine RANTES levels via targeting KLF13 in systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheumatism,2010,62(11):3425-3435.

[5]Cheng Z,Qiu S,Jiang L,et al.MiR-320a is downregulated in patients with myasthenia gravis and modulates inflammatory cytokines production by targeting mitogen-activated protein kinase 1[J]. J Clin Immunol, 2013, 33(3):567-76.

[6]Jiang L, Cheng Z, Qiu S, et al.Altered let-7 expression in myasthenia gravis and let-7c mediated regulation of IL-10 bydirectly targeting IL-10 in Jurkat cells[J].Int Immunopharmacol,2012,14(2):217-23.

[7]Lotte Christensen L, Tobiasen H, Holm A, et al. MiRNA-362-3p induces cell cycle arrest through targeting of E2F1, USF2 and PTPN1 and is associated with recurrence of colorectal cancer[J].Int J Cancer,2013,133(1):67-78.

[8]Paraskevi A,Theodoropoulos G,Papaconstantinou I,et al. Circulating microRNA in inflammatory bowel disease[J]. J Crohns Colitis,2012, 6(9): 900-904.

[9]Eigsti RL,Sudan B,Wilson ME, et al.Regulation of activation-associated microRNA accumulation rates during monocyte-to-macrophage differentiation[J]. J Biol Chem,2014,289(41):28433-28447.

[11]Kim S,Choi M,Cho K H.Identifying the target mRNAs of microRNAs in colorectal cancer[J].Comput Biol Chem,2009, 33(1): 94-99.

(本文编辑：时秋宽)

Preliminary study of microRNA expression profiles in the abnormal thymus of generalized myasthenia gravis

QIUDi,LIJinpin*,MOXuean*,CHENZezhi,DUWeiwei,LIUJingli.

*DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,NanningGuangxi530021,China

LI Jinpin, Email:lijinpin009@163.com；MO Xuean, Email: mxa550@126.com

Objective To compare the expression of miRNAs between the abnormal thymus of generalized myasthenia gravis(GMG) and normal thymus tissue, and to develop primary understanding of the pathogenesis of GMG. Methods We investigated 8 thymus(4 thymomas and 4 thymic hyperplasias) of myasthenia gravis samples to examine miRNA expression profiles through miRNA microarray compared to 4 normal thymus. We also predicted the possible targets of miRNA by bioinformatics. Results The miRNA microarray chip analysis identified 16 miRNAs differentially expressed in thymomas of GMG compared with the health control group, 14 miRNAs were down-regulated and 2 up-regulated. In comparison between thymic hyperplasias GMG and the health control groups, 37 miRNAs are down-regulated, while 1 miRNA are up-regulated in the hyperplastic GMG group. Conclusions There is a specific miRNA profile in abnormal thymus(thymomas and thymic hyperplasia) of GMG comparing to normal thymus tissue. MiRNA might play an important role in the pathogenesis of GMG.

myasthenia gravis; thymoma; thymus hyperplasia; microRNAs; microchip analytical procedures; gene expression profiling

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.03.005

广西自然科学基金项目资助项目(2014GXNSFAA118262)；广西壮族自治区卫生厅科研资助项目(Z2007084、Z2011047)

530021 广西医科大学第一附属医院神经内科

李劲频，Email:lijinpin009@163.com；莫雪安，Email: mxa550@126.com

R746.1

A

1006-2963 (2015)03-0171-07

2015-01-29)