Plk1和Rb在皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义

李慎秋， 曾 芬， 李舒康， 石晓霞， 向 微

华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科，武汉 430030



临床研究

Plk1和Rb在皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义

李慎秋， 曾 芬， 李舒康， 石晓霞， 向 微

华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科，武汉 430030

目的 检测保罗样激酶1(Plk1)及视网膜母细胞瘤基因蛋白(Rb)在皮肤鳞状细胞癌(CSCC)及正常皮肤组织中的表达情况，探讨两者在CSCC发生发展中的作用，以期为CSCC早期筛查提供重要线索，同时寻求治疗的新靶点。方法 采用免疫组化Elivision法检测20例CSCC和20例正常皮肤组织中Plk1和Rb的表达情况。结果 在CSCC中Plk1蛋白的阳性表达显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；Rb蛋白的阳性表达显著低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Plk1和Rb参与了CSCC的发生发展过程。

皮肤鳞状细胞癌； Plk1； Rb

皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)系来源于皮肤或附属器角质形成细胞的一种恶性肿瘤。虽然大多数CSCC患者能治愈，但一旦发生转移，预后往往不佳。为了提高发生转移患者的生存率并降低该病的死亡人数，新预后指标的发现以及新治疗方法的发展是至关重要的。保罗样激酶1(Plk1)是一类保守的丝苏氨酸酶，在细胞周期中的作用至关重要，并且可以与多种肿瘤抑制基因相互作用，影响肿瘤的发生。本研究采用免疫组化Elivision法检测Plk1和视网膜母细胞瘤基因蛋白(Rb)在CSCC和正常皮肤组织中的表达情况，以探讨它们在CSCC发生、发展中的作用以及两者之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本 所收集的20例皮肤鳞状细胞癌标本均来自华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科门诊2011年至2013年间手术切除的CSCC患者的石蜡包埋组织，并经病理学确诊。其中男10例，女10例，年龄24～86岁，平均年龄59.8岁，手术前均未接受放疗、化疗、中医中药、靶向药物等抗肿瘤治疗。对照组均来自华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科新鲜收集的正常皮肤组织。

1.1.2 主要试剂 兔抗人Plk1单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司。即用型Rb鼠抗人单克隆抗体购自福建迈新生物技术开发有限公司。

1.2 实验方法

采用免疫组织化学Elivision染色方法对20例CSCC组织和正常皮肤组织做Plk1和Rb染色。抗体浓度分别为1：100和1：50，具体操作参见试剂说明书，用已知的阳性表达Plk1和Rb的结肠癌组织作阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定

参照许良中等[1]的方法，综合考虑切片中阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比和阳性细胞着色强度两项指标，半定量判定结果。根据显色程度判断阳性强度，分为4级：无着色为阴性，0分；淡黄色为弱阳性，1分；棕黄色为中度阳性，2分；棕褐色为强阳性，3分。根据阳性细胞数量在观察的同类细胞中所占比例，分为4类：阳性细胞<2%，0分；阳性细胞2%～，1分；阳性细胞21%～，2分；阳性细胞>60%，3分；综合评价值由两类计分分值的乘积表示，0～3分为(-)，4分为(+)，6分为()，9分为()。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，Plk1、Rb在CSCC与正常皮肤之间表达的差异采用非参数秩和检验Mann-Whitney U检验法，Plk1与Rb阳性表达的相关性用Spearman相关分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Plk1在CSCC和正常皮肤组织中的表达情况

Plk1蛋白表达于细胞核和细胞质。在20例CSCC中，有3例呈强阳性表达，8例呈中度阳性表达，8例呈弱阳性表达，1例为阴性表达；在20例正常皮肤组织中，无强阳性及中度阳性表达，6例呈弱阳性表达，14例为阴性表达。CSCC和正常皮肤组织比较，差异有统计学意义(u=4.657，P<0.01)。见表1，图1。

表1 Plk1在CSCC和正常皮肤组织中的表达

A：Plk1在正常皮肤的阴性表达(×200)；B：Plk1在正常皮肤的阳性表达(×200)；C：Plk1在CSCC中的阴性表达(×200)；D：Plk1在CSCC中的阳性表达(×200)

2.2 Rb在CSCC和正常皮肤组织中的表达情况

Rb蛋白表达于细胞核。在20例CSCC中，有2例呈强阳性表达，2例呈中度阳性表达，10例呈弱阳性表达，6例呈阴性表达；在20例正常皮肤组织中，无强阳性表达，11例呈中度阳性表达，7例呈弱阳性表达，2例为阴性表达。两者相比较，差异有统计学意义(u=2.017，P<0.05)。见表2，图2。

表2 Rb在CSCC和正常皮肤组织中的表达

A：Rb在正常皮肤的阴性表达(×200)；B：Rb在正常皮肤的阳性表达(×200)；C：Rb在CSCC中的阴性表达(×200)；D：Rb在CSCC中的阳性表达(×200)

2.3 CSCC中Plk1和Rb蛋白表达的相关性

CSCC中Plk1和Rb蛋白表达的相关性见表3，采用Spearman等级相关分析方法，rs=0.091，P>0.05，差异无统计学意义，提示CSCC中Plk1与Rb蛋白的表达无相关性。

表3 CSCC中Plk1和Rb表达的关系

3 讨论

皮肤鳞状细胞癌(CSCC)是仅次于基底细胞癌的第二常见表皮肿瘤，在美国其所致死亡人数占所有皮肤肿瘤死亡人数的20%[2]。CSCC的恶性程度与多种因素有关系，包括肿瘤的大小、部位、肿瘤细胞分化程度、病理分级及淋巴转移等。目前尚缺乏准确检测CSCC早期转移和预后的方法，也缺乏治疗转移和复发CSCC的有效手段。因此，有关CSCC发生、发展及其侵袭、转移机制的研究对指导其诊断、治疗及评价预后具有重要的意义。

保罗样激酶1(Polo-like kinase 1，Plk1)是一类高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞周期中的作用至关重要，参与有丝分裂进入、纺锤体形成、细胞质分裂等[3]。Plk1在细胞有丝分裂中的重要作用，引起人们对Plk1与肿瘤之间关系的研究。有研究证实高表达Plk1的NIH3T3成纤维转化细胞能使细胞在软琼脂上生长，并且能在裸鼠体内形成肿瘤。同时，还有大量研究通过应用siRNA或小分子抑制剂，发现Plk1能使细胞有丝分裂停止，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡以及使小鼠体内肿瘤生长受到抑制[4]。以上研究说明Plk1在细胞增殖中起关键作用，它的过表达能促进肿瘤转化，在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。Rizki等[5]研究发现Plk1与肿瘤细胞穿过细胞外基质而入侵其他组织有关，提示Plk1在肿瘤侵袭过程中也有一定的作用。目前发现人类多种肿瘤组织中Plk1高表达，如乳腺癌、卵巢癌、食管癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤等均有高表达现象。更重要的是，Plk1的高表达和很多种肿瘤的侵袭行为和不良预后密切相关，如：非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结直肠癌、胃癌和甲状腺癌[6]。这些研究结果使得Plk1成为非常具有吸引力的靶向肿瘤治疗的候选分子。在本研究中，采用免疫组化的方法对Plk1蛋白在CSCC中表达情况进行了检测，结果显示在CSCC组织中，Plk1蛋白表达于细胞核和细胞质，这与研究者在乳腺癌中的免疫组化结果[7]是相符的。我们的研究发现Plk1在CSCC中的表达强度明显高于对照组，差异有统计学意义。这与Schmit等[8]的研究结果一致。Plk1在CSCC及正常皮肤组织中表达的差异性，提示Plk1通过参与细胞周期的调控，造成细胞的分裂增殖异常，导致CSCC的发生。

Rb基因是最早被发现的抑癌基因，其生物学功能包括肿瘤抑制、细胞周期调节、细胞分化和凋亡、维持染色体的稳定性，诱导与维持衰老，调控血管生成等[9]。研究发现，Rb基因可由于突变、缺失或与病毒癌蛋白的结合而失表达或功能失活，导致细胞处于无限制的生长状态，从而引起肿瘤的发生[10]。Ertel等[11]研究发现，在乳腺癌中Rb的缺失表达与不良预后有联系，而在雌激素受体阴性的乳腺癌中，Rb缺失表达预示着良好的化疗反应，Wakasugi等[12]研究说明Rb的活化状态与淋巴结的低转移率相关联(P<0.01)，而Pietilainen等[13]研究证实Rb基因参与乳腺癌细胞的生长调节，但是对于乳腺癌的临床预后没有意义。Cordon-Cardo等[14]通过免疫组化实验发现在膀胱癌中Rb蛋白的低表达与预后不良显著相关，但是Jahnson等[15]的研究未发现Rb与预后有关系。关于Rb是否与肿瘤的大小、分级、预后及淋巴结转移有关联，仍然存在争议，但是能肯定的是Rb失表达或表达降低参与了肿瘤的形成。在本研究中，采用免疫组化的方法对Rb蛋白在CSCC中表达情况进行了检测，结果显示在CSCC和正常皮肤组织中，Rb蛋白定位于胞核。我们的研究发现Rb蛋白在CSCC中的表达强度明显低于对照组，并且差异有统计学意义。这就提示了Rb表达缺失或下降在CSCC的发生发展中发挥了重大作用。

Gunawardena等[16]发现Plk1是Rb通路的一个靶点，Rb家族的激活可以使Plk1衰减，反之，Rb缺失就失去对Plk1的抑制。Rb的激活抑制了Plk1的启动子，该抑制作用依赖于SWI/SNF染色质重塑复合体，其作用是使Plk1启动子的组蛋白去乙酰化。若该过程受阻断，即使在Rb激活的情况下，Plk1的表达也不受抑制。这就从理论上说明了Plk1与Rb的表达应该是负相关。在CSCC发生发展过程中[17]，Plk1蛋白过度表达直接促进正常细胞生长为肿瘤细胞，而Rb蛋白表达缺失或失活对细胞的快速异常生长分化失去控制，两者相互作用在CSCC发生发展中起着重要作用。本研究结果显示，在CSCC中Plk1与Rb的表达强度无相关性。本研究发现，CSCC中有较高的Rb蛋白阳性表达率(14/20例，达70%)，笔者分析有两个原因：一个原因可能是由于突变型Rb蛋白的表达，另一个原因可能是样本量较小。鉴于Plk1与Rb在CSCC发病机制中的重要作用，还是能为肿瘤的诊断、治疗以及预后提供一些基本的理论依据，尤其在抗肿瘤药物治疗靶点的研究上。

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(2014-08-21 收稿)

Expression of Plk1 and Rb in Cutaneous Squamous Cell Carcinoma and Its Significance

Li Shenqiu，Zeng Fen，Li Shukangetal

DepartmentofDermatology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To detect the expression of Polo-like kinase 1(Plk1)and retinoblastoma protein(Rb)in cutaneous squamous cell carcinoma(CSCC)and normal skin tissues，and to investigate the role of Plk1 and Rb in the occurrence and development of CSCC，in an attempt to provide clues for early screening of CSCC，and identify new therapeutic targets for CSCC.Methods Immunohistochemical Elivision method was applied to detect the expression of Plk1 and Rb in 20 cases of CSCC tissues and 20 cases of normal skin tissues.Results The expression level of Plk1 in CSCC was significantly higher than that in the normal controls，with statistically significant difference noted between groups(P<0.01).The level of expression of Rb in CSCC was significantly lower than that in the normal controls，and there was a statistically significant difference(P<0.05).Conclusion Plk1 and Rb are implicated in the occurrence and development of CSCC.

cutaneous squamous cell carcinoma； Polo-like kinase 1(plk1)； retinoblastoma protein(Rb)

R739.5

10.3870/j.issn.1672-0741.2015.05.015

李慎秋，男，1956年生，主任医师，E-mail：sqli@tjh.tjmu.edu.cn