蛋氨酸脑啡肽小鼠体内抗癌活性初探

刘 璐， 游如旭， 单风平， 曾凡波， 贺国芳△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，武汉 4300302华中科技大学同济医学院药学院药物研究中心，武汉 4300303中国医科大学基础医学院免疫学教研室，沈阳 110001



蛋氨酸脑啡肽小鼠体内抗癌活性初探

刘 璐1， 游如旭2， 单风平3， 曾凡波2， 贺国芳1△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，武汉 4300302华中科技大学同济医学院药学院药物研究中心，武汉 4300303中国医科大学基础医学院免疫学教研室，沈阳 110001

目的 研究蛋氨酸脑啡肽(MEK)是否具有抗癌、增加化疗药物疗效和增强或保护免疫功能的作用。方法 BALB/c小鼠40只，右腋皮下接种H22癌细胞，接种24 h后随机分为5组，依次为阴性对照组(生理盐水0.2 mL/kg)、5-Fu组(10 mg/kg)、MEK组(200 mg/kg)、5-Fu+MEK联合给药组(10 mg/kg+200 mg/kg)和阳性对照组(20 mg/kg 5-Fu)。腹腔注射受试药品，每日1次，连续给药8 d，处死动物。计算肿瘤抑制率、胸腺和脾脏脏器指数以及测定CD3+和CD4+T细胞表达。结果 单独给予MEK 200 mg/kg或5-Fu 10 mg/kg时两组对肿瘤的抑制作用相近，对肿瘤的抑制率分别为75.13%和74.26%；联合给予MEK和5-Fu时，其抑瘤率为88.25%，明显高于单独使用5-Fu。MEK对小鼠脾脏及胸腺无明显抑制作用，与5-Fu合用时能显著减轻5-Fu对免疫脏器胸腺的抑制作用。单独给予MEK 200 mg/kg时，能明显提高荷瘤小鼠的CD3+和CD4+T细胞表达，与阴性对照组和5-Fu各剂量组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 MEK具有良好的抗肿瘤活性及增强机体免疫功能的作用，与化疗药物合用能增强其疗效同时减轻其毒性，对免疫脏器有保护作用。

蛋氨酸脑啡肽； 抑制肿瘤； 减毒增效； 免疫功能

脑啡肽是由5个氨基酸残基组成的多肽，是发现最早的在体内能直接作用于阿片受体的内源性物质。内源性阿片肽是体内具有阿片样活性的一类物质，分布广泛，通过作用于不同部位的各种类型的阿片受体发挥复杂多样的生理作用。根据脑啡肽的第5位氨基酸残基上的氨基酸不同，将其分为蛋氨酸(甲硫氨酸)脑啡肽(methionine-enkephalin，MEK)和亮氨酸脑啡肽(Leucine-enkephalin，LEK)[1]。作为内源性阿片样物质，脑啡肽具有强大的镇痛作用，因此对MEK的早期研究都是将其作为镇痛剂和神经递质来进行的，随着研究逐步深入，越来越多的研究表明MEK在调节免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖以及诱导肿瘤细胞凋亡中也发挥着作用。但目前大多只是通过体外细胞模型对MEK的抗肿瘤活性进行体外研究，本实验则选取BALB/c种小鼠为实验对象，皮下接种H22肿瘤细胞，建立皮下移植瘤模型，初步探寻MEK在体内调节免疫和抑制肿瘤的作用。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

蛋氨酸脑啡肽，批号20110106，由中国医科大学基础医学院免疫学教研室单风平教授惠赠，临用前以生理盐水配制成所需浓度；氟尿嘧啶(5-Fu)注射液，250 mg/10 mL，上海旭东海普药业有限公司生产，批号201102181，实验时取该注射液4 mL，以生理盐水稀释至100 mL；小鼠CD3、CD4分子ELISA检测试剂盒，批号20110601A，购于武汉鼎国生物技术有限公司。BALB/c种小鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，体质量20～24 g，每次实验所用小鼠性别一致；小鼠肿瘤细胞H22，由华中科技大学同济医学院药学院药物研究实验室提供。

1.2 实验方法

BALB/c小鼠40只，雌性，体质量(24±1)g。每只小鼠右腋皮下接种H22肿瘤细胞(细胞浓度约5×106/mL)建立皮下移植瘤模型，然后随机分为5组，每组8只。于接种24 h后各组按以下剂量给药：第1组为阴性对照组，以0.2 mL/kg生理盐水腹腔注射；第2组为5-Fu低剂量组，腹腔注射5-Fu，剂量为10 mg/kg；第3组设为MEK组，腹腔注射MEK，剂量为200 mg/kg；第4组为5-Fu+MEK联合用药组，剂量为10 mg/kg 5-Fu+200 mg/kg MEK腹腔注射给药；第5组为阳性对照组，腹腔注射大剂量5-Fu，剂量为20 mg/kg。各组每日给药1次，连续给药8 d，待阴性对照组肿瘤平均生长1 g以上，可进行评价。

处死动物前，眼眶静脉取血，冷藏备用，用于测定CD3+、CD4+细胞浓度，具体测定方法按试剂盒说明书操作。随后采取断颈法处死动物，记录体重。解剖肿瘤，称瘤重，计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率=(空白组瘤重-给药组瘤重)/空白组瘤重×100%。当肿瘤抑制率≥30%，并与阴性对照组相比P<0.05时为有效。同时解剖分离出胸腺和脾脏，分别称重，计算脏器指数评价药物对小鼠免疫器官的保护作用，脏器指数=胸腺或脾脏(mg)/小鼠体重(g)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 MEK与5-FU对肿瘤的抑制作用

从表1可见，分别单独给予受试荷瘤小鼠200 mg/kg MEK和10 mg/kg 5-FU时，与阴性对照组相比，两组均显示出非常显著的抑制肿瘤的作用(P<0.01)，并且两组对肿瘤的抑制程度相近，抑瘤率分别为75.13%和74.26%；单独给予受试荷瘤小鼠20 mg/kg 5-Fu时，其对肿瘤抑制率为88.33%；当同时给予受试荷瘤小鼠200 mg/kg MEK和10 mg/kg 5-Fu时，对肿瘤抑制率为88.25%，其抑制肿瘤的活性较单独使用10 mg/kg 5-Fu或MEK提高约13%，两者合并用药的抑制肿瘤作用与单独给予5-Fu 20 mg/kg具有相近的活性，提示MEK与化疗药物联合使用有增强药物疗效的作用。

从体重变化分析，阴性对照组小鼠体重增长率约为23.22%，与阴性对照组相比，10 mg/kg和20 mg/kg 5-Fu对小鼠体重增长均有影响，其增长率分别为15.57%和13.80%，即小鼠体重增长速度减慢，推断该结果与5-Fu毒性相关；MEK单用时，小鼠体重增长率较阴性对照组无差别，为23.92%，提示200 mg/kg MEK对小鼠生长无明显影响；200 mg/kg MEK与10 mg/kg 5-Fu合并用药时，小鼠体重增长率为18.62%，提示MEK有减轻5-Fu毒性的作用。

2.2 MEK与5-Fu对荷瘤小鼠脾脏、胸腺的影响

从表2可见，与阴性对照组相比较，不同剂量的5-Fu对荷瘤小鼠的脾脏、胸腺均有明显的抑制作用(均P<0.05)，且随着剂量的增加，抑制作用也增强。当MEK剂量为200 mg/kg时，与阴性对照组比较，对荷瘤小鼠脾脏、胸腺的影响差异无统计学意义(均P>0.05)；当联合使用200 mg/kg MEK和10 mg/kg 5-Fu时，能明显抑制荷瘤小鼠的脾脏和胸腺(均P<0.05)，但对荷瘤小鼠胸腺的抑制作用显著低于单独应用10 mg/kg 5-Fu组(P<0.05)。结果提示，当合并用药时，MEK可减轻化疗药物对荷瘤小鼠免疫脏器胸腺的抑制，具有脏器保护作用。

表1 MEK与5-Fu对荷瘤小鼠体重增长的影响及抑瘤率

与阴性对照组比较，**P<0.01

表2 MEK与5-Fu对荷瘤小鼠脾脏、胸腺的影响

与阴性对照组比较，*P<0.05**P<0.01；与10 mg/kg 5-Fu组比较，△P<0.05

2.3 MEK与5-Fu对荷瘤小鼠外周血CD3+、CD4+T细胞表达的影响

从表3可见，当分别给予荷瘤小鼠10 mg/kg和20 mg/kg 5-Fu时，荷瘤小鼠外周血的CD3+和CD4+T细胞表达均较低；单独给予荷瘤小鼠200 mg/kg MEK或合并给予MEK和5-FU时，能明显提高荷瘤小鼠的CD3+和CD4+T细胞表达，与阴性对照组和5-Fu剂量组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。提示MEK与5-Fu合并用药能拮抗5-Fu降CD3+和CD4+T细胞表达的作用，MEK有增强机体免疫功能的作用。

表3 MEK与5-Fu对荷瘤小鼠血清外周血CD3+和CD4+T细胞表达的影响

与阴性对照组比较，*P<0.05；与10 mg/kg 5-Fu组比较，△P<0.05

3 讨论

阿片类药物长久以来在临床应用中显示出强大的镇痛效果，作为内源性阿片样物质，脑啡肽能通过直接作用于阿片受体而发挥疗效。近年来，随着对阿片样物质研究的深入，越来越多的研究表明，脑啡肽在调节机体免疫功能以及抗肿瘤方面显示着良好的作用。在应用动物移植性肿瘤的体内试验中，研究者发现单独使用蛋氨酸脑啡肽(MEK)或者与注射用重组人干扰素(IFN-γ)或注射用白细胞介素-2(IL-2)联合应用时都对小鼠移植性瘤有一定的抑制作用，并且MEK和IFN-γ/IL-2联合应用时显示出良好的抗肿瘤协同效应，而不良反应并无加重表现[2-3]。将MEK应用于由于放化疗导致的免疫系统受到损伤的晚期肿瘤志愿者时，研究结果显示患者免疫系统指标全面迅速恢复，淋巴细胞亚群间比例趋于合理，证明MEK在帮助癌症患者恢复免疫系统功能方面具有一定疗效[4]。章旭等[5]从基因水平探讨MEK对小鼠CD4+T细胞mRNA转录的影响，体外试验结果显示适量浓度的MEK体外刺激能促进小鼠CD4+T细胞mRNA的高效表达。Zagon等[6]分别选取了人成纤维细胞瘤细胞SK-N-SH、头颈部鳞状上皮癌细胞SCC-1和CAL-27三种癌细胞系，体外实验证明MEK通过与其受体结合能抑制肿瘤细胞的生长。

目前大多数对MEK药理活性的研究还只是停留在体外实验中，或是将MEK作为辅助用药与其他药物合用研究其协同作用。在本实验中，我们建立了移植瘤小鼠模型，通过体内实验分别观察了MEK对肿瘤生长的抑制，对免疫器官(胸腺、脾脏)的保护和对细胞因子的影响，同时，将MEK与临床常用化疗药物5-Fu合用，观察其是否具有协同作用，是否能减轻化疗药物对机体的毒性。实验结果表明，当给予荷瘤小鼠剂量为200 mg/kg的MEK时，无论是单独使用还是与化疗药物5-Fu合并用药，都显示出显著的抑制肿瘤活性，抑制荷瘤小鼠肿瘤增长的作用。胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，免疫器官的脏器指数是衡量机体免疫功能的基本指标，当MEK与5-Fu合用时在增强化疗药物作用的同时能减轻由化疗药物所带来的毒性作用，对荷瘤小鼠免疫脏器(胸腺、脾脏)有明显的保护作用，且与化疗药合用时能提高化疗时荷瘤小鼠的免疫功能，上述体内实验说明MEK具有调节免疫和抑制肿瘤生长的作用。

人体免疫细胞表面广泛存在着能与MEK结合的δ受体、μ受体，通过与受体结合，MEK发挥其免疫调节作用[1]。细胞因子对免疫反应和细胞增殖具有调节作用，MEK通过影响细胞因子的释放间接调控免疫反应和细胞增殖[1，7-8]。因其对细胞生长具有抑制作用，MEK也被称为阿片生长因子(opioid growth factor，OGF)，Zagon等[9]发现，OGF及受体存在于多种肿瘤细胞中。适宜浓度的MEK能通过与受体作用而激活免疫细胞，特别是增加T淋巴细胞活性，显著增加CD2、CD4、CD8等受体分子的表达[4，10-11]。机体维持正常免疫功能有赖于各种免疫细胞的相互协同作用，淋巴细胞(包括T淋巴细胞、B细胞、自然杀伤细胞等)，是免疫细胞的基本成分，CD3在全部T细胞上都有表达，依功能不同又进一步分为不同亚群，其中辅助性T细胞即CD4+T细胞可识别肿瘤细胞分泌的抗原，并参与多种免疫细胞的激活，进而发挥抗肿瘤作用。在本实验中，无论是单独给予受试小鼠MEK还是与5-Fu合用都能显著提高荷瘤小鼠CD3+和CD4+T细胞表达，对MEK能激活免疫细胞进行了体内实验验证。虽然目前对MEK尚缺乏较深入研究，其抗肿瘤作用还处在研究初始阶段，其抗肿瘤、调节机体免疫的机制还有很多未知的地方，但作为内源性物质，MEK无细胞毒性，且具有很强的抑制癌细胞生长的功能，其受体广泛存在于多种癌细胞表面，因此进一步开发MEK作为抗肿瘤的治疗药物，将具有良好的临床应用前景。本实验体内研究结果和相关体外研究结果为进一步研究MEK的药理作用提供了依据。

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(2015-06-24 收稿)

Anti-tumor Activity of Methionine-enkephalin(MEK)in MiceInVivo

Liu Lu1，You Ruxu2，Shan Fengping3etal

1DepartmentofPharmacy，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofDrugResearch，SchoolofPharmacy，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China3DepartmentofImmunology，SchoolofBasicMedicalSciences，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China

Objective To study the anti-tumor，chemotherapy-sensitizing and immune-enhancing roles of methionine-enkephalin(MEK).Methods Experimental BALB/c mice were subcutaneously inoculated with H22tumor cells in right axillary regions.They were divided into 5 groups at random：negative control group(0.2 mL/kg NaCl)，5-Fu group(10 mg/kg 5-Fu)，MEK group(200 mg/kg MEK)，5-Fu+MEK group(10 mg/kg 5-Fu+200 mg/kg MEK)and positive control group(20 mg/kg 5-Fu).Animals in each group were intraperitoneally injected with agents once a day for 8 days after inoculated with tumor cells 24 h later.The anti-tumor rate，organ indexes of the thymus and spleen and the proportion of CD3+/CD4+were calculated.Results The anti-tumor rate was 75.13% in MEK group and 74.26% in 5-Fu group and there was no significant difference.It was 88.25% in 5-Fu+MEK group，significantly higher than in 5-Fu group.MEK had no significant inhibition on the spleen and thymus.The inhibitive effect of 5-Fu on the thymus and spleen was significantly attenuated after administration with MEK.Moreover，MEK could enhance the proportion of CD3+and CD4+significantly(P<0.05)，and statistical difference was noted between MEK group and control or 5-Fu group.Conclusion MEK has remarkable anti-tumor activity and it can booster immune functions，enhance the efficacy of chemotherapeutics while reducing their toxicity when co-administered.Meantime，it could protect the immune organs.

methionine-enkephalin(MEK)； anti-tumor； attenuating and synergistic effect； immune function

R979.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2015.05.006

刘 璐，女，1980年生，药学博士，主管药师，E-mail：luliu1980@hotmail.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：heguofang82@aliyun.com